申晉波，沈勇偉，張 林

跟腱損傷在跨欄、跳高、跳遠、短跑等田徑以及足球、籃球、網(wǎng)球等球類運動項目中十分常見。跟腱損傷之后很難治療，一旦跟腱斷裂，運動員將很有可能永遠離開賽場，結(jié)束運動生涯。力竭性跟腱損傷作為急性跟腱損傷的代表，在運動員中占有很大的比例，對于普通人來說，不合理的生活方式、重復(fù)性的工作活動很容易產(chǎn)生跟腱損傷；對運動員和軍人來說，持續(xù)性的運動訓(xùn)練也會發(fā)生跟腱損傷[1]。因此對于力竭性跟腱損傷的診斷、預(yù)防、治療、恢復(fù)就顯得格外重要。

由于跟腱結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及其病變的多樣性，使得眾多學(xué)者對于跟腱損傷的認(rèn)識不統(tǒng)一，目前對于跟腱損傷治療方法的研究比較少，有的也只是停留在藥物治療和手術(shù)治療階段。近年來眾多研究表明，跟腱并不是無活性的，由此盡可能選擇一種微創(chuàng)甚至無創(chuàng)的治療方法進而激發(fā)跟腱的自愈能力、提高其恢復(fù)效果。而低功率激光療法（low level light therapy，LLLT）作為一種常用的物理療法，能對生物體產(chǎn)生特定的生物刺激作用（光生物調(diào)節(jié)作用），引起某些生物學(xué)效應(yīng)的同時并不產(chǎn)生熱量。因此，探討低功率激光照射跟腱，對跟腱組織所起的作用和影響，探索跟腱損傷的發(fā)病機制，篩選一些與跟腱損傷和修復(fù)有關(guān)并且有效的指標(biāo)，探尋一種治療跟腱損傷科學(xué)、合理的方法顯得十分必要和急需。目前，低功率激光已經(jīng)在許多國家應(yīng)用，但一些學(xué)者對低功率激光的療效和作用還存在異議，也許這與研究過程中采用的激光參數(shù)（如波長、照射強度、劑量、照射時間）不同有關(guān)，也可能與所選動物類型及照射部位不同有一定的關(guān)系。

蛋白多糖是肌腱細胞外基質(zhì)的主要成分之一，它對肌腱膠原修復(fù)的作用主要是通過TGF的調(diào)節(jié)和抑制膠原纖維的形成等機制來實現(xiàn)的。膠原纖維和蛋白多糖之間存在復(fù)雜的編織排列可能就是肌腱的功能、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。蛋白多糖在維持肌腱的結(jié)構(gòu)與功能中起著至關(guān)重要的作用[3]。

本實驗以一次性離心力竭跑臺運動大鼠為研究對象，通過低功率激光照射其跟腱，觀察低功率激光照射對一次性離心力竭大鼠跟腱的膠原纖維排布，測定蛋白多糖含量的變化，探討低功率激光在跟腱微損傷后早期恢復(fù)中是否有效，是否能加快和促進微損傷的修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組

8周齡健康清潔級雄性Wistar大鼠60只（由蘇州大學(xué)動物實驗中心提供），平均體重為（189±6.6）g，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行隨機分組。

空白對照組：N=6；一次性離心力竭跑臺運動組：N=54；造模對照組（即刻）：N=6；自然愈合組：N=24，分為自然愈合1 d、2 d、3 d、7 d；激光治療組：N=24，分為激光治療1 d、2 d、3 d、7 d。實驗動物分組見表1。

表1 實驗動物分組TableⅠ Groups of the Rats for Experiment

1.2 動物的飼養(yǎng)

將60只Wistar大鼠分組后，每籠6只進行飼養(yǎng)，自由進食與飲水，用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料進行喂養(yǎng)。動物房溫度保持在18～24℃、相對濕度為45%～55%，予以充足的自然光照,每天12 h。

1.3 實驗方法

1.3.1 運動方案

大鼠進行一次性離心力竭跑臺運動前，將運動組大鼠進行3次適應(yīng)性訓(xùn)練，運動速度為10 m/min，每次運動時間為5 min（跑臺運動組大鼠均在中國杭州段式跑臺BCPT-98型號跑步機上進行），正式運動前，先將跑臺調(diào)整至-16°（即下坡跑），然后將大鼠置于跑臺中，讓其安靜30 min，隨后進行跑臺運動，負荷共分為3級：I級負荷：速度為10 m/min，時間15 min；II級負荷：速度為15 m/min，時間15 min；III級負荷：速度為20 m/min，運動至力竭為止。力竭運動模型參照北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院和Bedford方法加以修改的遞增負荷力竭跑臺運動方案[15]。

大鼠力竭的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠跑臺姿式由蹬地式變?yōu)榉厥?，滯留于跑道末端不能繼續(xù)跑動，且聲波和光刺激均不能驅(qū)使大鼠繼續(xù)維持跑動狀態(tài)。

1.3.2 激光照射方法

激光照射采用半導(dǎo)體低功率激光器（蘇州大學(xué)物理激光研究所制造），波長為635 nm，功率為15 mW，照射面積為1.2 cm2，照射時間為10 min，每日1次。在大鼠力竭跑臺造模結(jié)束后，對激光治療組大鼠跟腱部位采用該低功率激光照射方法。

自然愈合組與激光照射組在處死之前均給予以充足的水和純鼠料喂養(yǎng)。

1.4 樣品取材與處理

采用10%的水合氯醛溶液（3 mL/100 g）注射大鼠腹腔進行麻醉，并保證每組于同一時間點取材。

1.4.1 HE染色光鏡觀察

HE染色光鏡觀察樣品：取右側(cè)跟腱，去除腱圍，得到跟腱樣品，迅速放入10%的福爾馬林中固定。固定后的組塊依次入梯度酒精脫水（75%→85%→95%→100%），二甲苯透明，使用德國Leica-EG1160型全自動石蠟包埋機進行包埋。使用Leica-RM2145型石蠟切片將蠟塊進行橫向和縱向連續(xù)切片，切片厚度為5μm。再進二甲苯脫蠟，梯度灑精脫水（100%→95%→85%→75%），水洗后進行HE染色，經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。按常規(guī)方法進行HE染色。然后將HE染色組織切片置于OLYMPUS-BX51型光學(xué)鏡下，首先在10×10倍下觀察標(biāo)本，確定觀察位置，然后在40×10倍下觀察跟腱中的膠原纖維狀態(tài)及腱細胞有無炎性變化。

1.4.2 大鼠跟腱蛋白多糖含量

蛋白多糖含量樣品：大鼠麻醉固定后迅速剝離后肢跟腱，去除腱圍及相連肌肉，置于凍存管中，在液氮中速凍1 h，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。測定原理：采用雙抗體夾心ABCELISA法，用抗大鼠I型膠原、III型膠原及IGF-I單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的蛋白多糖與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠蛋白多糖，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測OD值，各檢測指標(biāo)濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中檢測指標(biāo)濃度(試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供)。

1.5 統(tǒng)計分析

結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理，采用方差分析，顯著性水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 跟腱HE染色光鏡觀察結(jié)果

空白對照組：跟腱組織順應(yīng)力方向排列整齊，膠原呈平行排列且規(guī)則，其結(jié)構(gòu)致密，膠原與膠原之間距離均勻、緊湊，可以清晰觀察到腱細胞，一般都處于安靜期；一次性離心力竭運動后即刻造模對照組：可見跟腱周圍組織充血、水腫，局部排列錯亂；膠原纖維間隔增多（圖1）。

圖1 空白對照組與即刻造模對照組大鼠跟腱光鏡下表現(xiàn)（HE,10×40）Figure 1 Behavior of the Control Group and the Instant Model Establishing Group in the Achilles Tendon Light Microscope (HE,10×40)

一次性離心力竭運動后3 d：兩組均有部分腱細胞變大，核清晰，染色淺，嗜堿性；激光治療組更明顯，表示腱細胞活躍，且代謝加快，提示其胞外組成蛋白多糖的能力增強（圖2）。

圖2自然愈合3天組激光治療3天組大鼠跟腱光鏡下表現(xiàn)（HE,10×40）Figure 2 Behavior of the 3-day Natural Healing Group and the 3-day Laser Irradiation Group in the Achilles Tendon Light Microscope(HE,10×40)

一次性離心力竭運動后7 d：自然愈合組尚未愈合，膠原纖維排列依舊紊亂；激光治療組基本愈合，腱細胞數(shù)量增多，膠原纖維排列趨于整齊，基本未見膠原瘢痕出現(xiàn)（圖3）。

圖3 自然愈合7d組與大鼠激光治療7d組跟腱光鏡下表現(xiàn)（HE,10×40）Figure 3 Behavior of the 7-day Natural Healing Group and the 7-day Laser Irradiation Group in the Achilles Tendon Light Microscope(HE,10×40)

2.2 大鼠跟腱蛋白多糖測試結(jié)果

2.2.1 空白對照組和造模對照組大鼠跟腱蛋白多糖含量

不同對照組大鼠跟腱蛋白多糖含量的測試結(jié)果顯示，造模后大鼠跟腱中蛋白多糖含量明顯下降，與空白對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.05）（見表2）。

表2 空白對照組與造模對照組蛋白多糖含量的比較(N=6)TableⅡ Comparison between the Proteoglycan Content of the Control Group and That of the Model Group (N=6)

2.2.2 激光照射組和自然愈合組大鼠跟腱蛋白多糖含量

隨著恢復(fù)時間的增加，大鼠跟腱中的蛋白多糖含量呈逐漸增加的趨勢（見表3）。

表3 造模后各組蛋白多糖含量的比較(N=6)Table Ⅲ Comparison between the Proteoglycan Content of the Different Groups after the Model was Established (N=6)

自然愈合組的蛋白多糖含量，在7 d中緩慢增加，自然愈合7 d組與造模對照組比較出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

激光照射組蛋白多糖含量變化趨勢與自然愈合組基本相同，但相同取材時間點蛋白多糖含量均比自然愈合組高，激光照射1 d組、2 d組與造模對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），第3 d、7 d時開始均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

激光照射組與自然愈合組比較，在造模后的第3 d、7 d均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

3.1 低功率激光照射對一次性離心力竭性大鼠跟腱組織學(xué)影響

跟腱在結(jié)構(gòu)上除了腱細胞以外，還存在著膠原及一些其他細胞外基質(zhì)。其中膠原占跟腱干重的60%以上。正常跟腱組織在光鏡下可見膠原順受力方向上規(guī)則的排列，并形成致密結(jié)構(gòu)。跟腱是粘彈性組織，其功能很大程度上取決于膠原的韌性和膠原結(jié)構(gòu)上的排列。一些研究表明：跟腱的微損傷可能是導(dǎo)致跟腱斷裂的主要原因之一[5]。但在機體當(dāng)中跟腱的微損傷和修復(fù)同時存在，力竭運動構(gòu)成的微損傷需要多久才能修復(fù)，修復(fù)后會不會存在瘢痕以及低功率激光在跟腱微損傷修復(fù)過程中所起的作用都還處于研究階段，并未達成共識。

本研究中，空白對照組光鏡下表現(xiàn)為：膠原呈平行排列且規(guī)則，其結(jié)構(gòu)致密，膠原與膠原之間距離均勻、緊湊，腱細胞處于安靜期。而經(jīng)過一次性離心力竭運動后即刻和自然愈合1 d組出現(xiàn)跟腱周圍組織充血、水腫，局部排列不規(guī)則，膠原纖維間隔增多。與李敏[2]等對一次性跑臺大鼠膠原纖維變化的研究結(jié)果相符。自然愈合組7 d時，膠原纖維仍然排列紊亂。激光治療組7 d時，腱細胞數(shù)量增多，膠原纖維排列比較整齊，表明基本愈合。因此，從組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果來看，低功率激光對一次性離心力竭大鼠跟腱微損傷的修復(fù)、提高腱細胞分泌功能有積極作用。

3.2 低功率激光照射對一次性離心力竭運動大鼠跟腱蛋白多糖含量的影響

蛋白多糖這一重要的細胞外基質(zhì)對肌腱膠原修復(fù)的作用主要是：（1）提高轉(zhuǎn)化生長因子的調(diào)節(jié)能力；（2）抑制膠原纖維的形成機制。蛋白多糖對維持肌腱的結(jié)構(gòu)與功能起著重要的作用，而膠原纖維與蛋白多糖之間存在復(fù)雜的編織排列，這可能就是肌腱結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，一次性離心力竭運動大鼠跟腱中蛋白多糖含量與空白對照組比，具有顯著性差異（P＜0.05），提示力竭運動后大鼠跟腱蛋白多糖含量明顯降低，隨著恢復(fù)時間的增加，跟腱中蛋白多糖的含量逐漸增加，這與之前的研究結(jié)果相吻合。

目前尚未見有關(guān)低功率激光照射對肌腱微損傷修復(fù)中蛋白多糖含量影響的研究報道。本研究顯示，一次性離心力竭運動大鼠跟腱在恢復(fù)階段，激光照射組蛋白多糖含量的變化與自然愈合組一樣，是隨時間增加而逐漸升高，但增加幅度要大于自然愈合組，并在第3 d就出現(xiàn)了顯著性差異，表明低功率激光照射能促進大鼠跟腱蛋白多糖的合成，加快跟腱細胞外基質(zhì)成分的恢復(fù)，有利于受損跟腱的修復(fù)。其原因可能是低功率激光對蛋白多糖合成的調(diào)節(jié)作用：低功率激光激活了蛋白多糖合成相關(guān)酶的活性，調(diào)控了蛋白多糖的合成代謝，從增加蛋白多糖的含量。低功率激光在增加蛋白多糖的合成同時也促進了膠原的生成，這有利于在膠原纖維與蛋白多糖之間形成適合于發(fā)揮肌腱性能的復(fù)雜的編織排列，從而改變肌腱的構(gòu)型，增強肌腱的功能，促進肌腱的修復(fù)。

4 結(jié)論

研究表明，低功率激光照射能通過改善蛋白多糖酶的活性和細胞因子的調(diào)控，調(diào)節(jié)蛋白多糖的合成，從而減少肌腱愈合中疤痕形成，提高跟腱功能恢復(fù)的效果。低功率激光雖然顯著地提高了跟腱局部組織蛋白多糖含量，但其效果與照射劑量、頻率以及激光的類型有很大關(guān)系。研究結(jié)果的差異可能與激光的類型、波長、劑量參數(shù)等的不同有關(guān)，低功率激光器的最佳劑量仍有待今后做進一步的研究。

[1]王人衛(wèi)，李擎，李建平等.優(yōu)秀羽乒排網(wǎng)運動員運動創(chuàng)傷流行病學(xué)調(diào)查研究[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（4）：419-422

[2]李敏.跑臺運動對大鼠跟腱的影響及其機制研究[D].蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文，2008.

[3]辛紹杰，鄒正升.細胞外基質(zhì)的代謝[J].世界華人消化雜志，2002，10（1）：54-56

[4]Pankaj S,Nicola M. (2005). Tendon injury and tendinopathy:healing and repair: current concept review[J].JBJS[Am], 87-A:187-202.

[5]Ker PF,Xang XT,Anna VL. (2000). Fatigue quality of mammalian tedons[J].The Journal of Experimental Biology,203:1317-1327.

[6]Worth N,Ghosh S,Msffulli N. (2007). Management of a-cute Achilles tendon ruptures in the United Kingdom[J].J Orth Surg,15(3):311-314.

[7]Korula MJ,Roger P. (2007). Surgical repair followed by functional rehabilitation for acute and chronic achilles tendon injuries:excellent functional results, patient satisfaction and noruptures[J].AnzJ Surg,77:287-291.

[8]張施龍，劉澤淼，林均馨，等.普通人群新鮮閉合性跟腱斷裂的臨床特征和手術(shù)療效[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（1）：55-57.

[9]Jcalder DF,Saxby TS. (2005). Early, active rehabilitation following mini-open repair of Achilles tendon rupture: a prospective study[J].Br J Sports Med,39:857-859.

[10]Nistor. (1981). Surgical and non-surgical treatment of Achilles tendon rupture. A prospective randomized study [J].J BoneJoint Surg Am,63(3):394-399.

[11]Moller M,Movin T,Granhed H,et al. (2001). Acute rupture of tendo Achills: a prospective, randomized study of comparison between surgical and non-surgical treatment[J].JBJS[Br], 83-B:843-848.

[12]Pankaj S,Nicola M. (2005). Tendon injury and tendinopathy:healing and repair: current concept review[J].JBJS[Am], 87-A:187-202.

[13]Amar AS,Carol S,David CR,et al. (2006). Postoperative rehabilitation protocols for Achilles tendon rupture: a Meta-analysis[J].Clinical Orthop edics and Related Research,445:216-221

[14]劉桂香.青少年運動訓(xùn)練跟腱損傷之防治[J].內(nèi)蒙古體育科技，2009，22（1）：36-38.

[15]楊東升，劉曉莉，喬德才.力竭運動過程中大鼠紋狀體葡萄糖/乳酸代謝的實時觀察[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（4）：384-387

[16]熊雁，張正治.核心蛋白聚糖在肌腱愈合作用中的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)·骨科學(xué)分冊，2005，26（3）：185-187.

[17]艾進偉，黃昌林，任強.兔跟腱基質(zhì)中膠原纖維和蛋白多糖結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀察[J].中國臨床康復(fù)，2005（06）：45-48.

[18]艾進偉，黃昌林，呂榮，等.制動對豚鼠跟腱基質(zhì)的影響[J].中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2005（05）：123-126.