李必強，林 威，姚恩輝，林 楠，黃培基

高血糖的內(nèi)環(huán)境可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的功能紊亂，是糖尿病患者血管病變的主要原因之一［1］。流行病學(xué)的研究顯示，糖尿病與心血管病變的危險性增加密切相關(guān)，糖尿病患者較一般患者心肌梗死后所需的恢復(fù)時間更長，出現(xiàn)梗死后心絞痛、梗死面積擴大和充血性心力衰竭的風(fēng)險更大［2］，其原因為糖尿病患者的冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的建立相對減弱，其中，高血糖對內(nèi)皮細胞功能的負面影響是導(dǎo)致該病理狀態(tài)的重要因素［3］。

小檗堿又名黃連素，是由中藥毛莨科植物黃連的干燥根狀莖中提取的一種異喹啉生物堿，已證實可用于代謝綜合征相關(guān)心血管疾患的治療［4］。有報道表明，小檗堿可降低高血糖對內(nèi)皮細胞的損傷，但其具體作用機制尚未得到全面闡明。本研究采用體外培養(yǎng)的永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）EA.hy926細胞為模型，研究小檗堿對高血糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞遷移的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 鹽酸小檗堿、D－葡萄糖及 MTT（四甲基偶氮唑藍）及二甲基亞砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM低糖及高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司，低糖培養(yǎng)基為EA.hy926細胞常規(guī)培養(yǎng)使用的含5.6mmol／L D－葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基，高糖培養(yǎng)基為含33mmol／L D－葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基）；Non－radioactive EMSA of NF－κB檢測試劑盒（TFDET001，美國Viagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) HUVEC EA.hy926（中科院上海細胞庫）解凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中。血管內(nèi)皮細胞呈梭形，融合生長時呈多角形單層鋪路石樣形態(tài)排列；當(dāng)細胞融合生長至80%左右，采用0.25%的胰蛋白酶消化，2～5代以內(nèi)的細胞用于實驗。

1.2.2 樣品配制 鹽酸小檗堿溶于DMSO，凍存于－20℃保存，臨用前以培養(yǎng)液稀釋到相應(yīng)終濃度，DMSO含量為0.5%。實驗分4組：D－葡萄糖5.6mmol／L組，即低糖培養(yǎng)組，采用5.6mmol／L的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)EA.hy926細胞；D－葡萄糖33mmol／L組，即高糖培養(yǎng)組，采用33mmol／L的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)EA.hy926細胞；D－葡萄糖33mmol／L＋ 小 檗 堿 2.5 μmol／L 組，即 經(jīng) 過2.5μmol／L的小檗堿處理過的高糖培養(yǎng)組；D－葡萄糖33mmol／L＋ 小 檗 堿 5μmol／L 組，即 經(jīng) 過5μmol／L的小檗堿處理過的高糖培養(yǎng)組。

1.2.3 細胞活性測定 將正常生長的內(nèi)皮細胞胰酶消化稀釋后按每孔5×103個接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，更換為相應(yīng)的樣品培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，加入 MTT溶液（5mg／mL），每孔10μL，孵育4h，棄培養(yǎng)液，DMSO溶解，酶標儀（570nm）測定吸光度。

1.2.4 劃痕試驗 參照文獻［5］，將EA.hy926細胞培養(yǎng)于24孔板，待細胞生長融合至80%左右時，用200μL微量加樣器頭在培養(yǎng)板中輕劃直線，寬約0.5mm，形成無細胞的裸露區(qū)域，采用PBS清洗培養(yǎng)板，將懸浮細胞清除；更換為含2%血清培養(yǎng)基的相應(yīng)供試溶液，連續(xù)觀察8h（2%的血清可加速細胞遷移速度，對細胞的增殖作用可忽略不計）。在低倍鏡下計數(shù)原裸露區(qū)域中內(nèi)皮細胞的遷入數(shù)量，用遷入數(shù)量與裸露區(qū)的面積比值表示細胞遷移率。

1.2.5 核因子－κB（NF－κB）活性測定 電泳遷移率改 變 法 （electrophoretic mobility shift assay，EMSA）測定NF－κB結(jié)合活性。以化學(xué)發(fā)光法檢測NF－κB的DNA結(jié)合活性，嚴格按說明書的要求完成相關(guān)實驗步驟。采用ImageJ 1.47V圖像分析軟件計算光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示。采用 Microsoft Office Excel 2003軟件t檢驗進行數(shù)據(jù)分析。每次試驗相同條件平行處理3～6個樣本，重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 高糖對細胞活性的影響 采用含不同濃度D－葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，MTT法檢測細胞活性，實驗結(jié)果顯示，2種條件下對EA.hy926細胞的增殖活性并無明顯的影響，高糖培養(yǎng)組細胞增殖活性僅略低于低糖培養(yǎng)組，2組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 小檗堿對 EA.hy9 2 6細胞活性的影響10～40μmol／L小檗堿可抑制EA.hy926細胞的增殖，且作用強度與劑量有關(guān)，但低于5μmol／L則抑制作用不明顯。

2.3 小檗堿逆轉(zhuǎn)高糖對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用相對于低糖培養(yǎng)基，33mmol／L高糖處理6h后，細胞的遷移率明顯降低（P＜0.05），表明高糖培養(yǎng)基可抑制內(nèi)皮細胞的遷移。然而，采用2.5及5μmol／L小檗堿同時處理后，細胞的遷移率得到一定程度的恢復(fù)，表明小檗堿可以逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用（表1，圖1）。

表1 小檗堿對高糖所致EA.hy926細胞遷移抑制作用及NF－κB DNA的結(jié)合活性的影響Tab1 Impact of berberine on the migration and NF－κB DNA binding activity in high－glucose treated EA.hy926cells

圖1 小檗堿對高糖所致EA.hy926細胞遷移抑制作用的影響（ ×100）Fig1 Impact of berberine on the migration of high－glucose treated EA.hy926cells（ ×100）

2.4 小檗堿抑制高糖誘導(dǎo)的NF－κB活性上調(diào) 不同處理條件6h后的EA.hy926細胞NF－κB DNA結(jié)合活性的相關(guān)實驗結(jié)果顯示，相對于低糖培養(yǎng)基，33mmol／L高糖處理6h后，NF－κB DNA 的結(jié)合活性明顯增強；然而，采用2.5及5μmol／L小檗堿同時處理后NF－κB DNA的結(jié)合活性受到一定程度的抑制，且作用強度與劑量有關(guān)（P＜0.01），表明小檗堿逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用可能與抑制高糖誘導(dǎo)NF－κB DNA的結(jié)合活性升高有關(guān)（表1，圖2）。

圖2 小檗堿對 EA.hy926細胞 NF－κB DNA 的結(jié)合活性的影響Fig2 Impact of berberine on NF－κB DNA binding activity in EA.hy926cells

3 討 論

研究證實，糖尿病患者的心血管相關(guān)疾病的死亡風(fēng)險遠高于非糖尿病患者［6－7］。糖尿病患者發(fā)生冠狀動脈病變后，死亡率明顯增加，并且更易出現(xiàn)心肌梗死的延展及充血性心力衰竭。有研究表明，合并糖尿病的冠心病患者側(cè)支循環(huán)產(chǎn)生的數(shù)量明顯少于非糖尿病患者，提示高血糖是冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的抑制因素［3］。因此，逆轉(zhuǎn)高血糖對冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的影響具有重要的臨床價值。

血管內(nèi)皮細胞是覆蓋在血管內(nèi)表面高度分化的單層細胞，是構(gòu)成血管的重要組成部分，血管內(nèi)皮細胞的遷移是冠狀動脈側(cè)支形成的重要步驟之一［8］。有研究表明，高血糖可抑制HUVEC以及人主動脈內(nèi)皮細胞（HAEC）的遷移、增殖及血管發(fā)生過程［1，9］。本研究采用永生化的 HUVEC EA.hy926研究高糖對內(nèi)皮細胞遷移的影響，實驗結(jié)果表明，在33mmol／L D－葡萄糖存在的條件下，相對于5.5mmol／L D－葡萄糖培養(yǎng)條件，EA.hy926的遷移受到明顯抑制，該結(jié)果與相關(guān)的文獻報道一致，說明高血糖確為新生血管形成的抑制因素。與以往的報道不同，筆者的實驗結(jié)果表明，不同濃度D－葡萄糖對EA.hy926活性的影響不大，推測可能與不同來源的細胞株及傳代培養(yǎng)條件有關(guān)，也說明高糖對內(nèi)皮細胞活性的影響可能并不是糖尿病類心血管疾病發(fā)生的主要原因，與相關(guān)文獻報道一致。

近年來，有關(guān)小檗堿的藥理活性研究得到進一步擴展，國內(nèi)外大量的科研證實小檗堿具有抗腫瘤及抗糖尿病作用［10－11］。有關(guān)小檗堿降血糖的作用機制已有較多報道，主要集中在降血糖作用及調(diào)節(jié)脂代謝作用方面，也有少數(shù)研究關(guān)注小檗堿對內(nèi)皮細胞的保護作用，認為小檗堿可以通過NO通路等途徑改善內(nèi)皮細胞功能［12］，但是否能影響內(nèi)皮細胞的遷移尚未見相關(guān)報道。在本研究中，筆者采用不同劑量（2.5，5μmol／L，該濃度條件對 EA.hy926細胞活性沒有明顯的影響）的小檗堿處理高糖環(huán)境下的EA.hy926細胞，實驗結(jié)果表明，小檗堿可以逆轉(zhuǎn)高糖對血管內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用，且作用強度與劑量有關(guān)，表明該作用可能也是小檗堿防治糖尿病性心血管疾病的作用機制之一。

有關(guān)小檗堿逆轉(zhuǎn)高糖對血管內(nèi)皮細胞遷移抑制作用的作用機制研究是基于如下考慮：首先，已有報道指出，NF－κB的激活是高糖抑制內(nèi)皮細胞遷移的主要因素［9］，此外有研究表明，小檗堿可抑制NF－κB的激活，從而發(fā)揮抗炎及抗腫瘤作用［13］；在此基礎(chǔ)上，也有研究認為小檗堿通過抑制NF－κB的激活達到對抗高糖對血管內(nèi)皮細胞的損傷［14］；故推測抑制NF－κB活性可能介導(dǎo)了小檗堿逆轉(zhuǎn)高糖對血管內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用。本研究證實，在體外培養(yǎng)的EA.hy926細胞模型水平，小檗堿可抑制高糖誘導(dǎo)的NF－κB激活，且作用強度與劑量有關(guān)，說明小檗堿逆轉(zhuǎn)高糖對血管內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用的作用機制與抑制NF－κB激活密切相關(guān)。

綜上所述，本研究表明小檗堿可通過抑制NF－κB活性上調(diào)逆轉(zhuǎn)高糖對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用。因此小檗堿不僅可以降低血糖，而且可能通過保護血管內(nèi)皮的正常生理功能從而達到預(yù)防和治療高血糖相關(guān)心血管類疾患的作用；此外，本研究提示以小檗堿為先導(dǎo)化合物開發(fā)新型血管內(nèi)皮細胞保護劑亦具有一定的科研價值。

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