王小慧，張國漪，李 蕊，盧穎林，冉 煒*，沈其榮

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095;2廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣州510316)

西瓜枯萎病是由西瓜?；图怄哏牭毒?Fusarium oxysporum f．sp．niveum)引起的，是導(dǎo)致西瓜生產(chǎn)毀滅性損失的土傳病害。隨著市場(chǎng)對(duì)西瓜需求量的增長，西瓜種植面積逐年擴(kuò)大，傳統(tǒng)的輪作防病措施難以實(shí)行，導(dǎo)致西瓜枯萎病日趨嚴(yán)重。據(jù)在京郊各區(qū)的調(diào)查結(jié)果，一般病株率在10% ～20%，重者達(dá) 80% ～90%，重茬地甚至造成絕產(chǎn)［1－2］。因此，尋找一種安全有效的防治西瓜枯萎病的方法迫在眉睫。

西瓜枯萎病的常規(guī)防治方法有輪作和套作、嫁接、施用化學(xué)農(nóng)藥和采用抗病品種等。輪作和套作是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常見的防治多種植物病害發(fā)生的有效措施，但由于病原菌的厚垣孢子能在土壤中存活10年左右，而且我國生產(chǎn)者的平均耕地面積小，實(shí)施過程難度大，輪作和套作的效果不十分明顯［3］。嫁接大多用南瓜作砧木，但無法解決種子攜帶病原菌的問題，而且西瓜嫁接時(shí)根腐病發(fā)生幾率大幅增加［4－5］。多年來高毒農(nóng)藥的使用也使得該病原菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，同時(shí)引起土壤、水體和大氣等環(huán)境污染，導(dǎo)致農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留增加，直接危害人類的健康及生存?？共∮N的研究在實(shí)際中也遇到很多困難，如西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種資源匱乏的限制［3］。近年來，人們致力于尋找有效的替代方法，比如生物防治，因其具有對(duì)環(huán)境友好、無污染、見效快等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是綜合防治西瓜枯萎病的措施之一，對(duì)生態(tài)平衡和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有特別重要的意義。

利用拮抗微生物防治土傳病害已有多年的研究并有一定規(guī)模的應(yīng)用，芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群，具有很強(qiáng)的抗逆能力和抗菌防病作用，許多性狀優(yōu)良的天然分離株已成功地應(yīng)用于植物病害生物防治［6］。利用微生物有機(jī)肥防治土傳病害不僅可以向植物根際施入特異性生防菌，抑制病原菌生長繁殖，防止土傳病害的發(fā)生，而且有機(jī)肥能提供豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)生防菌在土壤和植物根際定殖，大大提高其生防效果［7］，因此生產(chǎn)中人們已經(jīng)開始利用枯草芽孢桿菌［8］、短小芽孢桿菌［9］、解淀粉芽孢桿菌和吉氏芽孢桿菌［10］等來防治土傳病害。葡聚糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要成分之一，葡聚糖酶可以降解真菌的細(xì)胞壁，具有抗真菌和植物病原菌的活性［11］，因而篩選出既能降解病原菌細(xì)胞壁，又能給植物增加養(yǎng)分的拮抗菌對(duì)生產(chǎn)顯得尤為重要。類芽孢桿菌可產(chǎn)生具有抗菌活性的蛋白質(zhì)，且大多數(shù)為核糖體合成的細(xì)胞壁降解酶類，如β－1，3－葡聚糖酶，該酶可水解β－1，3－葡聚糖中的β－1，3－糖苷鍵，從而抑制植物病原真菌的生長與增殖，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性［12－13］。還能通過固氮和溶磷作用為宿主植物提供營養(yǎng)成分［14］，促進(jìn)植株生長。

本研究通過從健康土樣中分離篩選對(duì)西瓜枯萎病病原菌有不同生防效果的菌株，經(jīng)平板對(duì)峙和抑菌譜實(shí)驗(yàn)挑取2株用于制備微生物有機(jī)肥，研究其在溫室盆栽條件下的生防效果，最終獲得一株在西瓜苗期能高效拮抗枯萎病的菌株，同時(shí)分析其潛在的防治機(jī)理，包括拮抗菌對(duì)土壤微生物區(qū)系的改善和β－葡聚糖酶基因的檢測(cè)與克隆，以期為西瓜枯萎病專用微生物有機(jī)肥在生產(chǎn)上的有效施用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

分離拮抗菌的土樣分別采自江蘇南京美齡宮、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)菜園、金壇市連續(xù)15年秸稈還田地塊和施用蚯蚓糞的田間土壤的作物根際，土壤樣品采集后低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱保存待用。營養(yǎng)缽育苗采用江蘇宜興陸平村的健康水稻土，未種植過西瓜。盆栽試驗(yàn)土樣采自江蘇連云港西瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的大棚(第2年死亡率達(dá)100%)，采取表層0—30 cm砂土，保持土壤濕潤，封閉在袋中。用稀釋平板法計(jì)出連作土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量達(dá)104cfu/g(按干土計(jì)算)。

西瓜品種為感病品種早佳84－24，由新疆昌吉州西亞種子有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

供試病原菌株有西瓜枯萎病菌(F．oxysporum f．sp．niveum)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、甜瓜枯萎病菌(F．oxysporum f．sp．melonis)、香蕉枯萎病菌 (F．oxysporum f．sp．cubense)、煙 草 疫 霉(Phytophthora parasitica var．nicotiana)，均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 培養(yǎng)基

尖孢鐮刀菌選擇培養(yǎng)基:KH2PO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)e-Na-EDTA 0.01 g，L－天門冬酰胺2.0 g，D－半乳糖 20.0 g，蒸餾水1000 mL(121℃滅菌、20 min)。

抗生素類物質(zhì):二硝基苯(75%WP)1.0 g，牛膽汁0.5 g，Na2B4O7·10H2O 1.0 g，硫酸鏈霉素 0.3 g。培養(yǎng)基用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3.8±0.2。

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基:NaCl 33.0 g，葡萄糖0.8 g，放線菌酮 4.5 mg，多粘菌素 22.5mg，V8汁 326 mL，用蒸餾水定容至1000 mL，pH 5.2。

改良LB液體培養(yǎng)基即在普通LB培養(yǎng)基中加入0.5%的蔗糖。

β－葡聚糖培養(yǎng)基:蛋白胨1.0 g，牛肉浸膏0.5 g，NaCl 0.5 g，β － 葡聚糖 0.005 g，剛果紅 0.01 g ，pH 7.0。

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)［15］。

1.3 拮抗細(xì)菌的分離與純化

稱取土樣10 g加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)裝玻璃珠若干)，30℃、170 r/min振蕩30 min，靜止后取土壤懸液稀釋至10－3、10－4、10－5均勻涂布于PDA培養(yǎng)基，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。將西瓜枯萎病病原菌(LD)保藏種進(jìn)行活化，用打孔器(直徑5mm)在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌片，轉(zhuǎn)接至已涂布有土壤稀釋液的PDA平板中央，25℃培養(yǎng)72 h，用無菌接種針挑取有拮抗效果的菌落于NA培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化。采用對(duì)峙法將單菌落點(diǎn)接在距病原菌菌片20 mm處，每皿接種2個(gè)菌株，對(duì)角線為同一菌株(此為1個(gè)重復(fù))，每株病原菌做3個(gè)重復(fù)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(不接菌)。28℃培養(yǎng)6 d，測(cè)量抑菌帶和抑菌圈直徑。

1.4 抑菌譜試驗(yàn)

取本實(shí)驗(yàn)室保藏的不同病原菌菌株進(jìn)行活化，用滅菌打孔器(直徑5 mm)在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌片，轉(zhuǎn)接至PDA平板中央，28℃培養(yǎng)24 h，采用對(duì)峙法將抑菌效果較好的菌株點(diǎn)接在距病原菌菌片20 mm處，每皿接種2個(gè)菌株，對(duì)角線為同一菌株，每株病原菌做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(不接菌)。25℃培養(yǎng)6 d，測(cè)量病原菌的菌落直徑、抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=(對(duì)照病原菌直徑－與拮抗菌對(duì)峙的病原菌直徑)/對(duì)照病原菌直徑×100

1.5 溫室盆栽拮抗試驗(yàn)

1.5.1 生物有機(jī)肥制備 根據(jù)江蘇新天地生物肥料有限公司制備拮抗土傳病害微生物有機(jī)肥工藝，分別將2種功能菌CR38和Cy5的菌株懸浮液按20%(V/W)的量加入到腐熟好的有機(jī)肥(以豬糞與氨基酸有機(jī)肥按質(zhì)量比1∶1混合制成。菜粕氨基酸有機(jī)肥料，含有機(jī)質(zhì) 442g/kg、氨基酸 80 g/kg、N 44 g/kg、P2O535 g/kg、K2O 6.7 g/kg，水分 28.5%。豬糞堆肥含有機(jī)質(zhì) 534g/kg、N 36 g/kg、P2O547g/kg、K2O 11 g/kg、水分28.5%)中，發(fā)酵堆肥制成生物有機(jī)肥 BIO38、BIO5。

1.5.2 營養(yǎng)缽育苗的盆缽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按干土重量的2%施肥，共設(shè)3個(gè)處理:1)健康土壤+未接入功能菌的有機(jī)肥(簡稱營養(yǎng)缽CK);2)健康土壤+生物有機(jī)肥BIO38(簡稱營養(yǎng)缽BIO38);3)健康土壤+生物有機(jī)肥BIO5(簡稱營養(yǎng)缽BIO5)。

西瓜種子用5%NaClO溶液消毒2 min，再用無菌水沖洗3遍，于28℃培養(yǎng)箱避光催芽露白。播種于一次性小杯中，進(jìn)行營養(yǎng)缽育苗。每個(gè)杯子中加入300 g健康土壤，每個(gè)處理重復(fù)25次，播種前將肥料與土壤要充分混勻。營養(yǎng)缽苗期試驗(yàn)于2011年4月25日至同年5月10日(15 d)在溫室進(jìn)行。1.5.3盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按干土重量的0.5%施肥，共設(shè)3個(gè)處理:1)連作土壤+營養(yǎng)缽CK+未接入功能菌的有機(jī)肥(CK對(duì)照);2)連作土壤+營養(yǎng)缽BIO38+生物有機(jī)肥BIO38(BIO38);3)連作土壤+營養(yǎng)缽BIO5+生物有機(jī)肥BIO5(BIO5)

每個(gè)盆缽裝5 kg西瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的連作土壤，每個(gè)處理重復(fù)25次，所有處理施肥總量相等。待營養(yǎng)杯中的西瓜幼苗第2片真葉徹底展開，將幼苗連同杯中土壤一起移入大盆缽中，常規(guī)水肥管理。盆栽種植20 d后，計(jì)算發(fā)病率和防治效果，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［16］根據(jù)植株整株葉片、莖梗、枯萎或壞死的面積而定:0=0%，1=1～33%，2=30% ～66%，3=67%～100%，4=全株死亡。病情指數(shù)(DSI)=Σ(病害的級(jí)別×該級(jí)別的植株數(shù))/供試植株數(shù);發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/重復(fù)數(shù)×100%;防治率=(對(duì)照發(fā)病率－處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率×100%。

采集各處理發(fā)病程度接近的植株測(cè)定西瓜株高及生物量。抖落所有粘在西瓜植株根系上的土壤后，將根稱重，按每克根加9 mL無菌水的比例放入事先裝有玻璃珠的試管中，再將試管放置在渦旋儀上渦旋5 min，洗脫在無菌水中的土壤即為根際土壤，分別采用NA培養(yǎng)基、枯草芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、尖孢鐮刀選擇性培養(yǎng)基對(duì)其中的細(xì)菌、芽孢桿菌、放線菌、真菌、尖孢鐮刀菌進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)。各種微生物的數(shù)量以烘干基計(jì)算。

1.6 菌株Cy5的β－葡聚糖酶活定性檢測(cè)和基因分析

將Cy5接種在β－葡聚糖培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板點(diǎn)接2個(gè)單菌落，重復(fù)3次，30℃培養(yǎng)3 d。觀察其在β－葡聚糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈的情況，同時(shí)測(cè)量水解圈的直徑大小，用于定性分析指示Cy5菌株產(chǎn)β－葡聚糖酶的能力。采用PCR法檢測(cè)拮抗菌β－葡聚糖酶的基因。提取細(xì)菌的DNA，以其為模板擴(kuò)增拮抗基因。PCR擴(kuò)增引物［17］F端為5－TTGCGAATGTGTTCTGGGAACC－3，R端為 5－TACTAATTGCTCGTATATTTTACCCA －3，目的片段大小為600 bp。PCR反應(yīng)體系為:模板DNA 1μL，上游、下游引物各 1 μL，dNTP 2 μL，10 × PCR 反應(yīng)緩沖液 2.5 μL，MgCl22.5 μL，Taq 酶(Promega)0.3 μL，ddH2O 14.7 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共33個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再將產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后送金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比較，采用 MEGA version 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7 菌株Cy5的鑒定

菌株的常規(guī)形態(tài)觀察、革蘭氏染色和生理生化鑒定參照文獻(xiàn)［18］。菌株的16S rDNA序列分析:提取細(xì)菌的總DNA［19］，然后采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物F為5’－ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－ 3’，R為5’－AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA － 3’［20］，由金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為:模板 DNA 1 μL，上游、下游引物各 1 μL，dNTP 4 μL，10 × PCR 反應(yīng)緩沖液 5 μL，MgCl25 μL，Taq 酶(Promega)0.5 μL，ddH2O 32.5μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 2 min;94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共 32個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(Axyprep DNA Gel Extraction Kit Axygen Biosciences)純化后pMD19－T-vector連接。16℃連接10 h，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑選陽性克隆，酶切質(zhì)粒DNA驗(yàn)證后，送金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索。選擇15條相近的序列(同源性在 99%以上)，采用 MEGA version 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，不同處理間差異顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯氏新復(fù)極差法，顯著性水平為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

從4份根際土壤中分離純化到對(duì)西瓜枯萎病菌有潛在拮抗作用的細(xì)菌有172株。通過平板對(duì)峙法復(fù)篩獲得抑菌圈直徑＞1cm，抑菌率在60%以上拮抗細(xì)菌有13株，占所有菌株的7.56%;其中Cy5、CR38的抑菌帶寬度≧4 mm，抑菌圈直徑＞2 cm，對(duì)病原菌菌絲的生長有較強(qiáng)抑制作用(表1)。

2.2 拮抗菌株Cy5與CR38對(duì)其它病原菌的抗性

為了研究篩選獲得拮抗菌株的生防潛力，采用對(duì)峙生長法對(duì)其抗菌譜進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示Cy5與CR38對(duì)供試病原菌有較好的拮抗效果(表2)。其中對(duì)香蕉枯萎病菌，甜瓜枯萎病菌，棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑＞2 cm，抑制率都在50%以上。棉花黃萎病菌生長速度非常緩慢，第10 d，抑菌帶＞5 mm，因沒有形成抑菌圈而無法測(cè)量。Cy5對(duì)煙草疫霉菌抑制率為50%，而CR38對(duì)煙草疫霉菌沒有抑制作用。

表1 分離菌株對(duì)西瓜枯萎病病原菌生長抑制作用Table 1 Antagonism reaction of strains against the pathogen of watermelon wilt

表2 拮抗菌株對(duì)不同病原菌的拮抗效果Table 2 Angatonistic bacteria inhibition against different pathogens

2.3 拮抗菌株Cy5與CR38對(duì)西瓜枯萎病的生防效果

溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Cy5與 CR38對(duì)西瓜枯萎病都有一定的防治效果。到收獲期CK處理的發(fā)病率為64%，BIO38處理的發(fā)病率為48%，BIO5為16%。BIO5處理的生防效果達(dá)75%，而BIO38處理的生防效果只有25%。與CK對(duì)照相比，BIO5處理植株的株高、地上部鮮重、地上部干重都達(dá)到顯著水平，分別增加64.8%、63.0%、50%。BIO38處理的株高比CK對(duì)照增加54.9%，地上部鮮重，地上部干重都沒有達(dá)到顯著水平(表3)。

施用不同菌株二次發(fā)酵的微生物有機(jī)肥對(duì)根際土壤微生物影響不同(表4)。與CK相比，BIO5處理根際土壤的細(xì)菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量均顯著增加，真菌與尖孢鐮刀菌的數(shù)量有所下降，放線菌變化不大;BIO38處理根際土壤的枯草芽孢桿菌和放線菌的數(shù)量明顯多于對(duì)照，其它三種微生物沒有明顯差異。BIO5處理根際土壤的細(xì)菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量分別比CK增加48.5%和61.1%;真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量分別下降52.1%、70.2%，而放線菌的數(shù)量沒有顯著差異。BIO38處理根際土壤的枯草芽孢桿菌和放線菌的數(shù)量分別比CK增加41.3%和31.3%，而細(xì)菌、真菌、尖孢鐮刀菌的數(shù)量變化不明顯。

表3 微生物有機(jī)肥對(duì)西瓜枯萎病的生防效果和對(duì)植株生長的影響Table 3 The effect of bio-organic fertilizer on control efficiency watermelon wilt and plant growth of water melon seedling

表4 施用微生物有機(jī)肥對(duì)根際土壤微生物的影響(cfu/g，soil)Table 4 Effects of bio-organic fertilizer on soil microbial population of watermelon rhizosphere

2.4 菌株Cy5的鑒定

在NA平板上，30℃生長24 h后的Cy5菌落呈乳白色，不透明，表面濕潤，邊緣光滑且粘稠。在水瓊脂的菌落很薄，常呈阿米巴狀擴(kuò)展。鏡檢為桿狀，革蘭氏G+，產(chǎn)芽孢、橢圓型。菌株的生理生化特征如下:發(fā)酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麥芽糖、木糖、纖維二糖、棉子糖、乳糖和甘露醇產(chǎn)酸，能水解淀粉，能利用尿素。苯丙氨酸反應(yīng)、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽利用和硝酸鹽還原反應(yīng)均為陰性。產(chǎn)糊精實(shí)驗(yàn)，V－P(Voges-Proskauer)反應(yīng)、甲基紅(M．R)反應(yīng)均為陽性。菌株Cy5的生理生化特征與Paenibacillus jamilae生理生化特征基本一致。16S rDNA序列分析表明，Cy5與P．jamilae的相似性最高，初步認(rèn)為其為P．jamilae，在NCBI上序列登陸號(hào)為JQ323092(圖1)。

2.5 菌株Cy5的β－葡聚糖酶定性檢測(cè)和基因分析

通過平板試驗(yàn)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cy5可在含β－葡聚糖平板上產(chǎn)生很明顯的水解圈，平均直徑為2.5 cm(圖2)。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)有一條介于500～750 bp之間的特異性條帶，與預(yù)計(jì)大小一致。該序列與已登陸的多粘芽孢桿菌(AY164457)(P．polymyxa AY164457)的 β －1，3－1，4－glucanase同源性達(dá)99%。

3 討論

人們過分追求高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效而改變傳統(tǒng)的種植制度導(dǎo)致的生態(tài)失衡是當(dāng)前土傳病害加劇發(fā)生的主要原因［21］。尤其是西瓜、甜瓜等在連作一年后就會(huì)發(fā)生枯萎病［22］。尖孢鐮刀菌是一種典型的土壤習(xí)居菌，屬于兼性寄生菌，寄主范圍廣。至今已報(bào)道的尖孢鐮刀菌專化型有80多種［23］，其中瓜類枯萎病菌有8個(gè)?；汀Ｓ酌缙谄渌鼘；涂汕趾Ψ亲陨砑闹鳎l(fā)生交叉感染，如尖孢鐮刀菌甜瓜專化型可侵染西瓜植株引起枯萎現(xiàn)象［24］。因此，在西瓜枯萎病的生物防治中，必須要篩選到同時(shí)抑制多種病原真菌才能提高防治效果。菌株Cy5與CR38不僅對(duì)西瓜枯萎病菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)對(duì)香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌和棉花黃萎病菌都有拮抗效果。Cy5還對(duì)煙草疫霉也有作用，說明菌株Cy5有較大的生防潛力。

土壤微生物是土壤中最活躍的肥力因子之一，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中占重要位置，對(duì)土壤結(jié)構(gòu)的改善和養(yǎng)分積累、轉(zhuǎn)化以及維持和促進(jìn)植物生長起重要作用［25］。根際有非常復(fù)雜的微生物群體，其中包括病原菌和有益微生物等。細(xì)菌是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要?jiǎng)恿?，在土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。放線菌產(chǎn)生抗生素和激素類物質(zhì)，有利于抑制有害微生物的生長。真菌雖在物質(zhì)分解中也起重要作用，但一些真菌與土傳病害有關(guān)。所以土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分含量及作物產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，而真菌數(shù)量與養(yǎng)分含量之間相關(guān)性較差［26］。在連作生態(tài)系統(tǒng)中，原有的微生物群體之間的平衡被打破，取而代之的是有益細(xì)菌數(shù)目減少，真菌不斷增加［27］。因此，在防治土傳病害的過程中，不僅要減少土傳病原菌和真菌的數(shù)量，而且要提高有益細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，使微生物區(qū)系向著健康和諧的方向發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)從根際分離到2株拮抗細(xì)菌在西瓜枯萎病苗期防治表現(xiàn)出不同的效果，從溫室效果來看，拮抗菌Cy5在防病促生方面的作用優(yōu)于CR38。BIO5處理的防治率高達(dá)75%，具有對(duì)植株生長的促進(jìn)作用十分明顯。BIO5處理根際土壤的細(xì)菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量均比CK對(duì)照顯著增加，而真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量大幅下降。BIO38處理根際土壤的枯草芽孢桿菌和放線菌的數(shù)量也顯著增加，但真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量與CK對(duì)照沒有明顯變化，說明增施用菌株Cy5發(fā)酵好的微生物有機(jī)肥有使連作土壤的微生物區(qū)系朝著更健康發(fā)展的潛力。

β－1，3－1，4－葡聚糖酶可以降解真菌的細(xì)胞壁，顯示抗真菌和植物病原菌的活性，對(duì)其研究已引起了廣泛的關(guān)注。姚烏蘭等［13］從多粘類芽孢桿菌WY110的分泌物中分離得到了β－1，3－1，4－葡聚糖酶，并驗(yàn)證了此酶具有抗稻瘟病菌活性;文鳳云等［28］發(fā)現(xiàn)重組β－1，3－1，4－葡聚糖酶對(duì)香蕉炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、出芽短梗霉以及尖孢鐮刀菌菌絲生長具有很強(qiáng)的抑制作用。劉玉嶺等［29］認(rèn)為重組溶菌酶L27沒有抑菌活性，而重組β－1，3－1，4－葡聚糖酶則有輕微的抑菌活性，但兩個(gè)重組蛋白的混合物卻比單一組分的抗菌活性高，表現(xiàn)協(xié)同作用。本試驗(yàn)分離到的Cy5菌株具有促生抗病作用，同時(shí)還能產(chǎn)生多粘類芽孢桿菌的β－1，3－1，4－葡聚糖酶，該蛋白是拮抗菌發(fā)酵液中抗真菌活性組分或其中之一［28］，對(duì)真菌生長抑制的活性作用提示其可作為農(nóng)業(yè)抗病蟲害新型藥物進(jìn)行開發(fā)研究。此外，β－l，3－l，4－葡聚糖酶還是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)用酶，該酶在飼料工業(yè)上可有效提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率和飼料營養(yǎng)的吸收效率［30］，在啤酒生產(chǎn)中加入該酶可解決β－葡聚糖引起的大麥難降解、黏度大的問題，以提高啤酒的質(zhì)量與穩(wěn)定性［31－32］，說明 β －1，3 －1，4 － 葡聚糖酶具有廣泛的應(yīng)用前景。

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