胡義杰，李志平，陳建明，沈 誠，宋 毅，鐘前進(jìn) (第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管外科，重慶 400042)

繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的主要病理學(xué)變化表現(xiàn)為表達(dá)α 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)細(xì)胞在增厚的血管壁中大量堆積。但關(guān)于這些細(xì)胞的來源以及大量堆積的機(jī)制尚未完全明確［1］。有研究報(bào)道肺動(dòng)脈血管壁中膜常駐平滑肌細(xì)胞去分化［2］;肺血管外膜的成纖維細(xì)胞的分化［3-4］;歸巢于血管損傷部位的循環(huán)祖細(xì)胞分化。因此這些表達(dá)α-SMA表型的成肌纖維細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性，其來源可能復(fù)雜多樣［5］;這也可能是目前臨床藥物治療效果欠佳的重要原因。近年來有報(bào)道認(rèn)為在腎臟纖維化和心肌纖維化過程中存在內(nèi)皮細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞或成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化［6-7］。那內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是否也是肺動(dòng)脈高壓形成中肺動(dòng)脈壁重塑的機(jī)制之一呢?因此本研究以低氧性肺動(dòng)脈高壓為基本模型，細(xì)胞水平對低氧培養(yǎng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表型變化及TGF-β1在此過程中的作用進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

健康6周左右SPF級SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物房)，皮下注射戊巴比妥鈉70 mg/kg麻醉。碘伏消毒固定大鼠的胸腹部。剪開下腹部腹腔，并沿正中線上延手術(shù)切口至頸部，同時(shí)打開腹腔和胸腔，暴露出心肺組織。前下提起心肺，剪斷主動(dòng)脈;切除心臟，顯露主肺動(dòng)脈和左右肺動(dòng)脈干。順肺動(dòng)脈干方向，切除肺組織和血管外膜，盡可能多的保留肺動(dòng)脈并注意避免損傷肺動(dòng)脈內(nèi)膜。將PBS清洗的節(jié)段肺動(dòng)脈血管，銳性切成小肺血管片。肺動(dòng)脈內(nèi)膜面貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Hyclone公司，美國)和支原體去除劑MRA 50 μl(Mpbio公司，美國)的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育。48～72 h后，去除血管片并繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。選擇第3～4代狀態(tài)好的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的低氧培養(yǎng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化

取對數(shù)生長期的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，做細(xì)胞爬片。將細(xì)胞爬片和處于對數(shù)生長期的細(xì)胞放入低氧培養(yǎng)箱(含1%O2、5%CO2、94%N2混合氣體)、37℃恒溫孵育。每兩天給細(xì)胞換液，并在低氧培養(yǎng)1 d、4 d、7 d時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，與常氧培養(yǎng)的細(xì)胞比較。低氧培養(yǎng)7 d結(jié)束后，細(xì)胞爬片用4%中性甲醛固定后4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ杖〕Ｑ跖囵B(yǎng)和低氧培養(yǎng)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，抽提總mRNA和總蛋白樣本并放－80℃保存?zhèn)溆?。取出固定的?xì)胞爬片，PBS洗3次，用0.1%Triton通透15 min，再用PBS洗3次，anti-α-SMA孵育過夜，PBS洗3次后再孵育對應(yīng)二抗1 h，PBS洗3次后DAB顯色3 min，用PBS洗去DAB后用中性樹脂封片。晾干后去照相。

1.3 TGF-β1及其抑制劑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)分組

大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在常氧培養(yǎng)下不同濃度TGF-β1及其抑制劑刺激后比較各組α-SMA蛋白表達(dá)差異。取對數(shù)生長期的細(xì)胞和細(xì)胞爬片，按下列條件分別給予刺激。刺激72 h后，抽提總蛋白樣本并放－80℃保存?zhèn)溆?。TGF-β1刺激組:①正常對照;②1 ng/mL TGF-β1;③5 ng/mL TGF-β1;④10 ng/mL TGF-β1;⑤50 ng/mL TGF-β1。在最佳 TGF-β1 刺激濃度基礎(chǔ)上，設(shè)定TGF-β1/SD-208刺激分組:①低氧實(shí)驗(yàn)組;②常氧組;③SD-208 0.5 μM 刺激組;④SD-208 0.5 μM+ 最佳濃度 TGF-β1刺激組;⑤最佳濃度TGF-β1刺激組。

1.4 TGF-β1 mRNA、蛋白表達(dá)和 α-SMA 蛋白水平

用Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄采用2 ug總RNA。常規(guī)RT-PCR分析TGF-β1 mRNA的水平。TGF-β1 cDNA的引物:上游引物5’-GCCCCTACATTTGGAGCCTG-3’，下游引物5’-CAGGAGCGCACGATCATGT-3’。內(nèi)參 β-actin引物為:上游引物 5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’，下游引物 5’-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3’。BCA法檢測總蛋白濃度。10%SDSPAGE膠電泳，電轉(zhuǎn)NC膜，封閉后加anti-TGF-β1抗體或antiα-SMA及對應(yīng)的二抗免疫印跡檢測TGF-β1或α-SMA蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 低氧原代培養(yǎng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為平滑肌樣細(xì)胞

肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)貼壁純化和傳代培養(yǎng)后，呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的鋪路石樣生長(圖1)。隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長，鋪路石樣內(nèi)皮細(xì)胞逐步向多角形細(xì)胞改變。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見α-SMA高表達(dá)的平滑肌樣細(xì)胞改變(圖2)。

2.2 TGF-β對肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

低氧培養(yǎng)7 d細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平都高于正常氧濃度培養(yǎng)組(圖3)。隨著TGF-β1刺激濃度的增加，細(xì)胞表達(dá)α-SMA的水平逐步增加(圖4A)。10 ng/mL TGF-β1刺激可見α-SMA較前增加明顯，因此將其設(shè)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳刺激濃度。單純10 ng/mL TGF-β1刺激與低氧所致的α-SMA水平增加相似;在予以TGF-β1抑制劑SD-208后，可見α-SMA表達(dá)水平幾乎恢復(fù)正常;單獨(dú)的SD-208對α-SMA表達(dá)并無顯著影響。

圖1 貼壁培養(yǎng)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(×10倍)

圖2 低氧培養(yǎng)7 d后肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為α-SMA高表達(dá)的平滑肌樣細(xì)胞(×40倍)

圖3 低氧培養(yǎng)7 d后細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平高于正常組

圖4 不同刺激條件對肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響

3 討論

肺動(dòng)脈高壓中重塑血管壁組織細(xì)胞來源和機(jī)制至今尚未完全明確。結(jié)合已有研究對心臟、腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)，本研究證實(shí)貼壁培養(yǎng)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在低氧培養(yǎng)條件下，能向平滑肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;且TGF-β1在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中具有重要意義。

穩(wěn)定培養(yǎng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是研究其轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象的基礎(chǔ)。目前肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)，主要有酶消化法、切碎并酶消化法、磁珠分離法、組織貼壁培養(yǎng)法。本實(shí)驗(yàn)采用了組織貼壁法。通過多次差速貼壁，呈鋪路石樣生長的內(nèi)皮細(xì)胞相對純化，在第3～4代培養(yǎng)后純度約98%，為實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定開展提供了基礎(chǔ)。

近年來越來越多的證據(jù)提示成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞存在轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象。在心血管發(fā)育過程中，房室管區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞表型(CD31)的心內(nèi)膜細(xì)胞逐步分化為間質(zhì)細(xì)胞的心內(nèi)膜墊內(nèi)皮細(xì)胞［8］。內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象也是心肌纖維化、腎臟纖維化過程甚至腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制之一。在Cre-lox基因標(biāo)記的小鼠心肌纖維化模型中發(fā)現(xiàn)27%～33%的成纖維細(xì)胞起源于內(nèi)皮細(xì)胞［7］。在多個(gè)腎臟纖維化模型中，近30% ～50%的成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表型CD31和成纖維特異蛋白或α-SMA;而采用內(nèi)皮細(xì)胞系示蹤系統(tǒng)證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［9］。在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的成纖維細(xì)胞，其來源也可能與內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化相關(guān)［10］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在低氧培養(yǎng)7 d后，鋪路石樣生長肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞向多角形的α-SMA高表達(dá)的平滑肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。這種內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化來源的細(xì)胞可能是血管壁重塑的重要機(jī)制之一。

TGF-β1在機(jī)體的損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、組織纖維化和腫瘤血管形成等過程發(fā)揮重要作用。近來研究證實(shí)TGF-β1在心臟、腎臟等多種組織的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中具有重要作用［9-11］。本研究證實(shí)低氧能上調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平;而TGF-β1能刺激肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，抑制TGF-β1能減少肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。故推測低氧性肺動(dòng)脈高壓形成的機(jī)制是通過TGF-β1信號通路實(shí)現(xiàn)的。在其他內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型中發(fā)現(xiàn)TGF-β1可能通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)分化。心肌纖維化模型中，miR-125b能降低p53表達(dá)水平，抑制 TGF-β1介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［12］;單獨(dú)miR-21的過表達(dá)可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，而沉默miR21可以降低心肌纖維化［13］。rhBMP可以拮抗TGF-β1，減輕心肌纖維化［7］。在低氧性肺動(dòng)脈高壓中TGF-β1調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制尚需更深入的實(shí)驗(yàn)予以闡明。

我們的研究為肺動(dòng)脈高壓異構(gòu)肺血管壁來源和機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對臨床防治肺動(dòng)脈高壓提供了新思路。但TGF-β1在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的作用機(jī)制十分復(fù)雜，還有待進(jìn)一步的研究才能全面闡明。

［1］Humbert M，Morrell NW，Archer SL，et al.Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2004，43(12 Suppl S):13S－24S.

［2］Jalali S，Ramanathan GK，Parthasarathy PT，et al.Mir-206 regulates pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and differentiation［J］.PloS one，2012，7(10):e46808.

［3］Stenmark KR，Davie N，F(xiàn)rid M，et al.Role of the adventitia in pulmonary vascular remodeling［J］.Physiology(Bethesda)，2006，21:134 －145.

［4］Stenmark KR，F(xiàn)rid MG，Yeager M，et al.Targeting the adventitial microenvironment in pulmonary hypertension:A potential approach to therapy that considers epigenetic change［J］.Pulm Circ，2012，2(1):3 －14.

［5］Frid MG，Dempsey EC，Durmowicz AG，et al.Smooth muscle cell heterogeneity in pulmonary and systemic vessels.Importance in vascular disease［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17(7):1203 －1209.

［6］Li J，Qu X，Bertram JF.Endothelial-myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.Am J Pathol，2009，175(4):1380 －1388.

［7］Zeisberg EM，Tarnavski O，Zeisberg M，et al.Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis［J］.Nat Med，2007，13(8):952－961.

［8］Liebner S，Cattelino A，Gallini R，et al.Beta-catenin is required for endothelial-mesenchymal transformation during heart cushion development in the mouse［J］.J Cell Biol，2004，166(3):359 －367.

［9］Zeisberg EM，Potenta SE，Sugimoto H，et al.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(12):2282 －2287.

［10］Zeisberg EM，Potenta S，Xie L，et al.Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts［J］.Cancer Res，2007，67(21):10123 －10128.

［11］Piera-Velazquez S，Li Z，Jimenez SA.Role of endothelial-mesenchymal transition(EndoMT)in the pathogenesis of fibrotic disorders［J］.Am J Pathol，2011，179(3):1074 －1080.

［12］Ghosh AK，Nagpal V，Covington JW，et al.Molecular basis of cardiac endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT):differential expression of microRNAs during EndMT［J］.Cell Signal，2012，24(5):1031－1036.

［13］Kumarswamy R，Volkmann I，Jazbutyte V，et al.Transforming growth factor-β-induced endothelial-to-mesenchymal transition is partly mediated by microRNA-21［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(2):361－369.