向 強(qiáng)，崔 翔，王加旭，劉明華 (第三軍醫(yī)大學(xué):.西南醫(yī)院急救部;.新橋醫(yī)院骨科，重慶 400038)

雙嗜性分子重組纖維連接蛋白/鈣粘附蛋白(recombinant fibronectin/cadherin chimera，rFN/CDH)實現(xiàn)了對FN和CDH11功能學(xué)的疊加［1］，本實驗把該融合蛋白引入雙相鈣磷陶瓷(Biphasic calcium phosphate ceramic，BCP)表面復(fù)合bMSCs制備組織工程骨，利用細(xì)胞離心粘附實驗、MTT實驗和成骨誘導(dǎo)分化等方法觀察骨種子細(xì)胞的粘附和分化，并把其應(yīng)用于兔腰椎橫突間植骨融合，觀察融合部位新骨生成狀況及種子細(xì)胞分布、轉(zhuǎn)歸狀況，為該組織工程骨的臨床研究和應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

rFN/CDH融合蛋白(實驗室自備)，方法見文獻(xiàn)［1］，多孔雙相鈣磷陶瓷(prous BCP)購于四川大學(xué)，DMEM/F12培養(yǎng)基，DTBP雙官交聯(lián)劑，MTT，胎牛血清，胰蛋白酶，TEMED，Trypsin，購于美國Sigma公司，ALP檢測試劑盒，細(xì)胞鈣含量檢測試劑盒(ARⅢ))，鈣結(jié)節(jié)染色試劑盒(茜素紅)購于南京建成生物材料有限公司。

1.2 bMSCs的分離和培養(yǎng)

選取健康7 d新西蘭大白兔仔兔(購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)，收集雙側(cè)股骨干骺骨髓3 mL，采用密度梯度離心貼壁篩選法。離收集細(xì)胞，加入percoll細(xì)胞分離液，收集白膜層的單個核細(xì)胞，洗滌、離心后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按105～106/mL的密度接種于無菌50 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)。在37℃、50%CO2、飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 hr換液棄去未貼壁細(xì)胞，加入DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、50%CO2、飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。倒置像差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長至3～6代、融合率達(dá)70%～80%時即可用以成骨誘導(dǎo)分化實驗。

1.3 bMSCs復(fù)合 rFN/CDH-BCP

將生長至第3代、融合率達(dá)70% ～80%的bMSCs以0.25%胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，計數(shù)、離心，制成密度為107/mL的單細(xì)胞懸液。將rFN/CDH-BCP平鋪于12孔板塑料小皿底部，以每孔1 mL單細(xì)胞懸液(1×107個細(xì)胞/孔)加入各孔rFN/CDH-BCP表面，在37℃、50%CO2、飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞充分貼附于rFN/CDH-BCP表面。

1.4 動物模型建立

選取健康成年新西蘭大白兔16只(購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，雌雄不限)，麻醉成功后消毒鋪巾，定位L4～L5間隙，后正中切口切開皮膚全層暴露至椎旁2～3 cm，暴露L4、L5橫突，打磨制備植骨床。每組隨機(jī)選取8只大白兔，分別將單純BCP材料(BCP植入組)或bMSCs復(fù)合rFN/CDH-BCP材料(bMSCs-BCP組織工程骨組)植入骨床處。術(shù)后3 d每日注射青霉素鈉40萬單位，每日2次。

1.5 指標(biāo)檢測

bMSCs復(fù)合rFN/CDH-BCP 24 h后，利用MTT實驗、掃描電鏡、熒光染色等方法觀察骨種子細(xì)胞的粘附、增殖和分化。利用X線影像學(xué)和組織學(xué)技術(shù)觀察融合部位新骨生成狀況及種子細(xì)胞分布、轉(zhuǎn)歸情況。

1.5.1 bMSCs增殖率和活力檢測 將BCP界面消毒、預(yù)濕后，置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，取bMSCs單細(xì)胞懸液(第3～6代)，以每孔2 000的初密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2、適度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～9 d，隔日換液1次;每日行MTT檢測，酶標(biāo)儀檢測并記錄各孔OD值(檢測波長570 nm)。

1.5.2 描電鏡觀察 在rFN/CDH-BCP界面上將300μl bMSCs細(xì)胞懸液以1 000/片的初密度接種，復(fù)合24 h，持續(xù)培養(yǎng)48 h后取出載有bMSCs的rFN/CDH-BCP，經(jīng)PBS液漂洗后3%戊二醛固定2 h，梯度酒精脫水，真空干燥8 h，真空鍍膜儀噴金鍍膜后SEM檢測觀察。

1.5.3 熒光染色 加入0.5mg/mL的Hoechst 33342母液培養(yǎng)至3～6代，密度為105/mL的bMSCs單細(xì)胞懸液，避光冰浴20 min，細(xì)胞標(biāo)記后細(xì)胞以100 μl/孔的體積(104個細(xì)胞/孔)加入96孔培養(yǎng)板各孔BCP表面，避光，胰酶消化，記錄各孔熒光強(qiáng)度，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱貼壁2～4 hr，熒光倒置顯微鏡觀測記錄，并用Viewfinder圖像分析軟件分析。

1.5.4 rFN/CDH-BCP界面細(xì)胞ALP活性測定 取各組誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的hMSCs，消化、離心、收集，加入細(xì)胞裂解液，吹打混勻，反復(fù) －70℃急凍和37℃融化3次，超聲破碎，離心12 000 r/min，1℃低溫離心15 min，收集上清檢測。

1.5.5 rFN/CDH-BCP界面細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色 采用茜素紅法，取誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d的hMSCs制成單細(xì)胞懸液(1×105/mL)，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，7 d后棄培養(yǎng)液，依次進(jìn)行GENMED固定，清理、染色，脫水，澄清，最后加入GENMED透亮液，光鏡下觀察。

1.5.6 X線觀察 術(shù)后1 d、1個月、3個月將兔麻醉后俯臥位、側(cè)位攝片，拍攝X線片，判斷各組材料在體內(nèi)成骨趨勢和融合情況、對比成骨差異。

1.5.7 組織學(xué)檢測 動物處死后，完整留取實驗融合部位組織塊，置入中性福爾馬林溶液中固定72 h，梯度酒精脫水，MMA包埋，硬組織切片機(jī)切片，HE染色和甲苯胺藍(lán)染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()的形式表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗分析各組有無統(tǒng)計學(xué)差異及其有效性，P＜0.05為顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:原代bMSCs培養(yǎng)72 h換液后，即可觀察到貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)短小，呈長梭型、紡錘形，培養(yǎng)至7 d，細(xì)胞明顯增多、變長、變大，長梭型、紡錘形形態(tài)更加明顯，14 d時，細(xì)胞基本鋪滿皿底，細(xì)胞排列呈螺旋狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)中，細(xì)胞基本保持長梭型的形態(tài)(圖1)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

2.2 bMSCs增殖率和活力的測定

bMSCs與rFN/CDH-BCP復(fù)合7 d內(nèi)測定細(xì)胞活力，繪制bMSCs增殖曲線圖顯示:rFN/CDH-BCP界面的增殖率和細(xì)胞活力在前7 d的培養(yǎng)時間內(nèi)，明顯高于陰性(BCP組)和陽性(FN-BCP組，CDH-BCP組)對照組(P＜0.05)，表現(xiàn)為 MTT還原產(chǎn)物溶液的吸光度顯著高于對照組，7 d以后各組吸光度無明顯差異(圖2)。

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡觀察顯示，在hMSCs與rFN/CDH-BCP復(fù)合界面有大量細(xì)胞粘附，細(xì)胞充分伸展充分，呈多邊形狀或圓盤狀，偽足樣結(jié)構(gòu)減少，形成致密的板層樣結(jié)構(gòu)覆蓋在材料表面，如圖中箭頭所示。在單純BCP界面，細(xì)胞伸展不良，呈條索狀，可見大量偽足樣結(jié)構(gòu)深入材料孔隙內(nèi)(圖3)。

圖2 bMSCs增殖曲線圖

圖3 rFN/CDH-BCP界面對hMSCs生長形態(tài)的影響

2.4 bMSCs粘附性測定。

細(xì)胞離心粘附實驗顯示在rFN/CDH-BCP界面，隨著rFN/CDH密度的增加，粘附的細(xì)胞數(shù)亦逐漸增多。rFN/CDH-BCP表面明顯優(yōu)于陽性對照CDH-BCP和FN-BCP組，同時熒光顯微鏡下觀測也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果(圖4)。

2.5 rFN/CDH-BCP界面ALP活性測定

ALP活性測定顯示在rFN/CDH-BCP表面的ALP活性表現(xiàn)最高，顯著高于陰性對照和陽性對照組，提示復(fù)合了bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨的成骨活性增強(qiáng)(圖5)。

2.6 rFN/CDH-BCP界面細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色

茜素紅法檢測成骨誘導(dǎo)后向細(xì)胞間鈣結(jié)節(jié)形成情況顯示，各組細(xì)胞間均有卵圓形、橘紅色均染的結(jié)節(jié)斑，以rFN/CDHBCP表面細(xì)胞形成最多，分布最廣，提示復(fù)合了bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨能促進(jìn)bMSCs的成骨分化(圖6)。

圖4 bMSCs在不同BCP處理表面粘附測定

圖5 bMSCs在不同處理因素BCP表面的ALP活性變化

圖6 bMSCs在不同處理因素BCP表面的鈣結(jié)節(jié)形態(tài)(茜素紅染色后鈣結(jié)節(jié)差異性表達(dá))

2.7 X線檢測

術(shù)后3個月X線檢測顯示，單純BCP移植組與橫突間未見明顯愈合，BCP材料依然清晰可見。bMSCs+rFN/CDH-BCP組織工程骨移植組橫突間及周圍已形成大量纖維骨痂結(jié)構(gòu)，材料與橫突周圍骨質(zhì)融為一體，界限模糊(圖7)。

圖7 組織工程骨植入后橫突間腰椎融合的X線放射學(xué)評價

雙盲法評估融合動物數(shù)量和橫突間隙骨痂填充率結(jié)果顯示:bMSCs復(fù)合rFN/CDH-BCP組織工程骨移植組達(dá)到100%融合率，單純BCP移植組融合率為40%。組織工程骨移植組橫突間隙的骨痂填充率也明顯優(yōu)于BCP組(P＜0.01)，提示其誘導(dǎo)新骨形成的能力增強(qiáng)(表1)。

表1 影像學(xué)表現(xiàn)下定量評估體內(nèi)骨愈合效果(，n=5)

表1 影像學(xué)表現(xiàn)下定量評估體內(nèi)骨愈合效果(，n=5)

*:與 BCP 組比較，P ＜0.01

2.8 組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察顯示，單純BCP植入組材料－骨床交界區(qū)以軟骨組織為主，新生骨成熟度較低，材料與骨床間無骨性融合和鈣化，組織學(xué)分級以軟骨組織為主。bMSCs復(fù)合rFN/CDH-BCP組植入組織學(xué)表現(xiàn)為融合區(qū)域出現(xiàn)成熟度較高的骨小梁交錯性橋接與材料融為一體，HE和甲苯胺藍(lán)染色均有特征性表現(xiàn)，顯示成骨能力顯著強(qiáng)于單純BCP植入組(圖8)。

圖8 復(fù)合bMSCs的rFN/CDH-BCP和單純BCP植入3個月的組織學(xué)觀察

3 討論

目前多樣化的骨替代材料，尤其是組織工程材料表現(xiàn)出了一定的臨床應(yīng)用前景，但由于材料本身特性單一，缺乏特定的結(jié)構(gòu)和分子信號，影響了細(xì)胞粘附到材料上的效率，并由此限制了隨后的材料－組織界面的骨誘導(dǎo)和骨生成作用［2］。為嘗試解決這一難題，我們把兼有纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和鈣粘附蛋白(Cadherin，CDH)功能特點的雙嗜性rFN/CDH融合蛋白引入多孔的雙相鈣磷陶瓷(Biphasic calcium phosphate ceramic，BCP)表面，以期獲得一種在體外具有高效粘附性和良好促進(jìn)骨種子細(xì)胞成骨分化潛能的生物界面，并對其實際應(yīng)用價值進(jìn)行評估。

細(xì)胞在材料界面的粘附與細(xì)胞遷移、增殖、分化，基質(zhì)沉積、血管芽生成，材料降解等息息相關(guān)［3］，細(xì)胞在材料表面的粘附特性是衡量材料生物相容性的一個重要指標(biāo)。在實驗中，我們采用離心促粘附實驗檢測了bMSCs在rFN/CDH-BCP界面的粘附狀況。離心促粘附實驗是通過適當(dāng)?shù)碾x心力促進(jìn)細(xì)胞與材料的結(jié)合/脫離，用熒光標(biāo)記的方法對有效粘附的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，具有準(zhǔn)確、簡捷、可控、假陽性率低的優(yōu)勢［4］。結(jié)果表明在BCP界面上粘附的hMSCs數(shù)量與rFN/CDH的密度成正相關(guān)，明顯高于單純BCP和FN、CDH修飾的BCP界面，證實了rFN/CDH修飾后的BCP界面對bMSCs的粘附能力明顯增強(qiáng)。

單純BCP材料對于細(xì)胞增殖無明顯影響［5］，為驗證bMSCs在rFN/CDH-BCP界面的活力和增殖能力，我們采用了MTT檢測法，MTT代謝產(chǎn)物的量與細(xì)胞數(shù)量和活力呈正相關(guān)。實驗結(jié)果顯示:rFN/CDH-BCP表面bMSCs的MTT代謝產(chǎn)物的量顯著增加，明顯高于單純BCP材料組，提示bMSCs在rFN/CDH-BCP表面的增殖率和細(xì)胞活力明顯優(yōu)于單純BCP材料。實驗通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在rFN/CDH-BCP材料的表面有大量bMSCs，細(xì)胞充分伸展充分，呈多邊形狀或圓盤狀，偽足樣結(jié)構(gòu)減少，形成致密的板層樣結(jié)構(gòu)覆蓋在材料表面。而單純BCP表面bMSCs少，細(xì)胞伸展不良，呈條索狀，可見大量偽足樣結(jié)構(gòu)深入材料孔隙，此結(jié)果有效地說明了rFN/CDH-BCP界面能增強(qiáng)種子細(xì)胞的活力和增殖能力。

ALP是成骨分化的早期標(biāo)志物為，茜素紅染色法檢測成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞間鈣結(jié)節(jié)形成是評價成骨終末作用的有效指標(biāo)［5］。實驗結(jié)果顯示rFN/CDH-BCP界面上bMSCs誘導(dǎo)10 d后ALP活力檢測已明顯增高，是單純BCP組的8.7倍(P ＜0.05)，由此說明rFN/CDH-BCP界面具有促進(jìn)種子細(xì)胞早期成骨分化的作用。實驗中把誘導(dǎo)21 d的bMSCs在體外繼續(xù)培養(yǎng)7 d，檢測成骨誘導(dǎo)后向細(xì)胞間的鈣結(jié)節(jié)形成情況顯示rFN/CDH-BCP表面的細(xì)胞間質(zhì)中存在大量的橘紅色鈣結(jié)節(jié)，提示此時進(jìn)入基質(zhì)礦化期，表明rFN/CDH-BCP表面具有更強(qiáng)信號以促進(jìn)分化成熟的成骨細(xì)胞礦化。

材料在生物體內(nèi)是涉及成千上萬的信號分子效應(yīng)蛋白和一系列胞內(nèi)和ECM級聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜過程［6］，通過組織學(xué)檢測則可對組織－材料界面上的基質(zhì)礦化、骨質(zhì)沉積和新骨形態(tài)進(jìn)行全面的了解［7］。把復(fù)合bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨用于兔腰椎橫突間融合術(shù)后取材，X線檢測顯示，單純BCP移植組與橫突間未見明顯愈合，BCP材料依然清晰可見。bMSCs+rFN/CDH-BCP組織工程骨移植組橫突間及周圍已形成大量纖維骨痂結(jié)構(gòu)，材料與橫突周圍骨質(zhì)融為一體，界限模糊為。組織學(xué)切片發(fā)現(xiàn)單純BCP植入組材料－骨床交界區(qū)以軟骨組織為主，新生骨成熟度較低，材料與骨床間無骨性融合和鈣化，組織學(xué)分級以軟骨組織為主。bMSCs復(fù)合rFN/CDH-BCP組植入組織學(xué)表現(xiàn)為融合區(qū)域出現(xiàn)成熟度較高的骨小梁交錯性橋接與材料融為一體，HE和甲苯胺藍(lán)染色均有特征性表現(xiàn)，顯示成骨能力顯著強(qiáng)于單純BCP植入組。實驗結(jié)果顯示，bMSCs+rFN/CDH-BCP組織工程骨具有促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附和成骨的良好生物學(xué)效應(yīng)，在體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性，是一種有廣闊應(yīng)用前景的骨修復(fù)材料。

［1］Zhang Y，Zhou Y，Zhu J，et al.Effect of a novel recombinant protein of fibronectinIII7-10/cadherin 11 EC1-2 on osteoblastic adhesion and differentiation［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(9):1999 －2006.

［2］Green DW，Watson GS，Watson J，et al.New biomimetic directions in regenerative ophthalmology［J］.Adv Healthc Mater，2012，1(2):140 －148.

［3］Krauss Juillerat F，Borcard F，Staedler D.Functionalization of microstructured open-porous bioceramic scaffolds with human fetal bone cells［J］.Bioconjug Chem，2012，23(11):2278 －2290.

［4］Reyes CD，García AJ.A centrifugation cell adhesion assay for highthroughput screening of biomaterial surfaces［J］.J Biomed Mater Res A，2003，67(1):328 －333.

［5］Li B，Chen X，Guo B，et al.Fabrication and cellular biocompatibility of porous carbonated biphasic calcium phosphate ceramics with a nanostructure［J］.Acta Biomater，2009，5(1):134 － 143.

［6］Fini M，Giavaresi G，Torricelli P，et al.Osteoporosis and biomaterial osteointegration［J］.Biomed Pharmacother，2004，58(9):487 －493.

［7］Magit DP，Maak T，Trioano N，et al.Healos/recombinant human growth and differentiation factor-5 induces posterolateral lumbar fusion in a New Zealand white rabbit model［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2006，31(19):2180－2188.