李 艾，李云凱，程 磊

（唐山學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河北 唐山063000）

乙醇（俗稱酒精）是一種綠色燃料，具有污染小、可再生、容易運(yùn)輸和儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)［1］。乙醇主要來源于糧食和糖料作物，通過微生物發(fā)酵把其中的淀粉或糖轉(zhuǎn)化而得。發(fā)酵主要由酵母菌引起。酵母發(fā)酵溫度一般不應(yīng)超過36℃，溫度過高，會(huì)導(dǎo)致酵母的老化或死亡，使發(fā)酵過程不能正常進(jìn)行。因此在發(fā)酵生產(chǎn)酒精過程中往往需要有冷卻這一工序，其目的在于使主發(fā)酵的基質(zhì)維持在一個(gè)適宜溫度，保證較高的酵母活性以便獲得較高的產(chǎn)酒率。假如能使主發(fā)酵基質(zhì)的溫度維持在38℃到40℃之間，那么既可以節(jié)省能源，又能在我國(guó)夏季高溫時(shí)節(jié)進(jìn)行正常的酒精發(fā)酵［2］。此外，酒精生產(chǎn)時(shí)糖化酶的最適溫度為60℃，若提高了發(fā)酵溫度，不僅可減少冷卻水的用量、使酶活力上升而且單位時(shí)間內(nèi)可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化率提高，發(fā)酵周期也會(huì)有所縮短。因此，篩選耐高溫、產(chǎn)酒性能好的菌株是很必要的［3］。

本文以實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母菌株為初始菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，篩選一株耐高溫、產(chǎn)酒率高的菌株，并進(jìn)一步探討其發(fā)酵特性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：釀酒酵母購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存中心，實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法

采用紫外分光光度法測(cè)定菌株（釀酒酵母）濃度。首先利用紫外分光光度計(jì)在560nm處以空白試劑作參比測(cè)得釀酒酵母OD（光密度）值。在一定范圍內(nèi)，菌體的濃度和所測(cè)得的光密度或濁度呈線性關(guān)系。因此，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制出釀酒酵母生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 釀酒酵母紫外誘變方法

采用單一誘變劑（紫外線）照射釀酒酵母，設(shè)定紫外燈功率10W，照射距離30cm，改變照射時(shí)間，篩選出耐高溫、產(chǎn)酒精高的菌株。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

取釀酒酵母斜面菌種1支，無菌操作接入YEPD培養(yǎng)液中，在30℃下恒溫培養(yǎng)24h，制成種子培養(yǎng)液。用2mL無菌移液管準(zhǔn)確吸取2mL種子培養(yǎng)液加入三角瓶中，于30℃下振蕩培養(yǎng)。然后分別對(duì)培養(yǎng)時(shí)間為0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h的培養(yǎng)液測(cè)定OD值。釀酒酵母生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

由圖1可明顯觀察到釀酒酵母菌體細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)3個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期。生長(zhǎng)曲線直觀地反映了該菌群在培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)、繁殖規(guī)律，該菌群在培養(yǎng)0～3h為延滯期，3～10h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10～16h為穩(wěn)定期。

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酵母菌活菌數(shù)目以穩(wěn)定的幾何指數(shù)增長(zhǎng)。此期間菌落形態(tài)、生物活性、染色都很典型，對(duì)環(huán)境因素的作用很敏感，因此選擇本實(shí)驗(yàn)的紫外誘變?cè)诖似陂g進(jìn)行。

在穩(wěn)定期，生長(zhǎng)菌群總數(shù)處于基本平穩(wěn)階段，但細(xì)胞群體活力變化很大。由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗、pH值下降、毒性產(chǎn)物積累等不利因素的影響，菌落染色、形態(tài)、生物活性出現(xiàn)改變，菌體開始產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，有利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。

2.2 釀酒酵母的誘變

2.2.1 菌懸液的制備

取已培養(yǎng)的24h的活化釀酒酵母斜面一支，用10mL生理鹽水將菌苔洗下，倒入試管中強(qiáng)烈振蕩10min，打碎菌塊，離心（1 000r／min）5min，棄上清液，將菌體用無菌水重復(fù)洗滌2次，最后制成菌懸液，使用XB－K－25型的血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)酵母菌的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并調(diào)整細(xì)胞濃度為107～108個(gè)／mL。血球計(jì)數(shù)板（規(guī)格25×16）測(cè)定酵母菌細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為

2.2．2 誘變

取菌懸液加入到6cm培養(yǎng)皿中，放入無菌磁力攪拌棒在距離10W紫外燈30cm處邊照射邊攪拌。誘變時(shí)間分別為2min，3min。關(guān)閉紫外燈，在黑暗中放置5min。

2.2.3 培養(yǎng)

取誘變后的菌懸液1mL用生理鹽水稀釋10倍，取2．5mL進(jìn)行涂板。將紫外誘變后的釀酒酵母菌株和初始釀酒酵母菌株分別在35℃，37℃，40℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其長(zhǎng)勢(shì)情況見表1。

表1 初始菌株和誘變菌株不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)情況

由表1可知初始釀酒酵母菌株在35℃，37℃條件下長(zhǎng)勢(shì)明顯變?nèi)酰?0℃的高溫下無菌落長(zhǎng)出，說明高溫破壞了菌體酶的活性，不利于菌株的生長(zhǎng)。經(jīng)紫外誘變的菌株在35℃，37℃條件下長(zhǎng)勢(shì)明顯好于初始菌株，且誘變3min的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于誘變2min的長(zhǎng)勢(shì)，說明誘變時(shí)間長(zhǎng)，菌株的致死率相對(duì)較高，產(chǎn)生的變異效果明顯。

2.3 釀酒酵母的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)與酒精含量測(cè)定

2.3.1 釀酒酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在無菌操作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)分別挑兩環(huán)初始菌株、誘變2min的菌株和誘變3min的菌株至YEPD培養(yǎng)基中，分別放入溫度為35℃，37℃，40℃培養(yǎng)箱中先120r／min的振蕩培養(yǎng)18h，后靜置培養(yǎng)54h。

2.3.2 酒精度測(cè)定

取以上各發(fā)酵液150mL，加入少量沸石進(jìn)行蒸餾，收集餾出液。用酒精計(jì)測(cè)定其酒精度。將菌株進(jìn)行編號(hào)，字母A代表誘變時(shí)間為2min的菌株，B代表誘變時(shí)間為3min的菌株，阿拉伯?dāng)?shù)字1代表35℃，2代表37℃，3代表40℃。酒精度的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 初始菌株及誘變菌株發(fā)酵酒精度的測(cè)定

由表2可知初始菌株，在35℃和37℃高溫條件下其發(fā)酵能力明顯下降。而誘變時(shí)間3min，誘變溫度37℃的菌株發(fā)酵能力最強(qiáng)，其成熟醪酒精的體積分?jǐn)?shù)可達(dá)3．837%；誘變時(shí)間3min，誘變溫度為35℃的菌株發(fā)酵能力次之，其成熟醪酒精的體積分?jǐn)?shù)為3．571%。結(jié)果表明，釀酒酵母經(jīng)誘變3min可適應(yīng)37℃的較高溫度，且具有較高的產(chǎn)酒率，故B2菌株為本實(shí)驗(yàn)篩選目的菌株。因此，通過紫外誘變成功選育出了一株耐高溫、高酒精產(chǎn)率的釀酒酵母菌株。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用紫外誘變方法，誘變篩選耐高溫、高產(chǎn)酒率的釀酒酵母。該方法簡(jiǎn)單易行，且有較高的誘變效率。利用紫外分光光度法測(cè)定菌株濃度，繪制出釀酒酵母生長(zhǎng)曲線，由此選擇了最佳的菌株誘變菌齡為3～10h，以此提高誘變得率。紫外線誘變的條件為：紫外燈功率10W；照射距離30 cm，照射時(shí)間3min。此條件下篩選出了一株耐37℃高溫，酒精產(chǎn)率為3．837%的釀酒酵母菌株。

［1］ 章克昌．發(fā)展“燃料酒精”的建議［J］．中國(guó)工程科學(xué)，2002，2（6）：89－93．

［2］ 馬曉建，孫鳳杰，劉龍飛．降低燃料乙醇生產(chǎn)成本若干問題的分析［J］．河南化工，2003（9）：4－7．

［3］ 池振明．高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，1995（4）：80－85．