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        紫外誘變釀酒酵母篩選耐高溫菌株

        2013-09-27 11:48:28李云凱
        唐山學(xué)院學(xué)報 2013年3期
        關(guān)鍵詞:耐高溫釀酒酵母菌

        李 艾,李云凱,程 磊

        (唐山學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系,河北 唐山063000)

        乙醇(俗稱酒精)是一種綠色燃料,具有污染小、可再生、容易運輸和儲藏等優(yōu)點[1]。乙醇主要來源于糧食和糖料作物,通過微生物發(fā)酵把其中的淀粉或糖轉(zhuǎn)化而得。發(fā)酵主要由酵母菌引起。酵母發(fā)酵溫度一般不應(yīng)超過36℃,溫度過高,會導(dǎo)致酵母的老化或死亡,使發(fā)酵過程不能正常進(jìn)行。因此在發(fā)酵生產(chǎn)酒精過程中往往需要有冷卻這一工序,其目的在于使主發(fā)酵的基質(zhì)維持在一個適宜溫度,保證較高的酵母活性以便獲得較高的產(chǎn)酒率。假如能使主發(fā)酵基質(zhì)的溫度維持在38℃到40℃之間,那么既可以節(jié)省能源,又能在我國夏季高溫時節(jié)進(jìn)行正常的酒精發(fā)酵[2]。此外,酒精生產(chǎn)時糖化酶的最適溫度為60℃,若提高了發(fā)酵溫度,不僅可減少冷卻水的用量、使酶活力上升而且單位時間內(nèi)可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化率提高,發(fā)酵周期也會有所縮短。因此,篩選耐高溫、產(chǎn)酒性能好的菌株是很必要的[3]。

        本文以實驗室保存的釀酒酵母菌株為初始菌株,對其進(jìn)行紫外誘變,篩選一株耐高溫、產(chǎn)酒率高的菌株,并進(jìn)一步探討其發(fā)酵特性。

        1 材料和方法

        1.1 實驗材料

        菌株:釀酒酵母購自中國工業(yè)微生物菌種保存中心,實驗室4℃冰箱保存。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 釀酒酵母生長曲線的測定方法

        采用紫外分光光度法測定菌株(釀酒酵母)濃度。首先利用紫外分光光度計在560nm處以空白試劑作參比測得釀酒酵母OD(光密度)值。在一定范圍內(nèi),菌體的濃度和所測得的光密度或濁度呈線性關(guān)系。因此,定時測定培養(yǎng)液的OD值,然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo),生長時間為橫坐標(biāo),繪制出釀酒酵母生長曲線。

        1.2.2 釀酒酵母紫外誘變方法

        采用單一誘變劑(紫外線)照射釀酒酵母,設(shè)定紫外燈功率10W,照射距離30cm,改變照射時間,篩選出耐高溫、產(chǎn)酒精高的菌株。

        2 實驗結(jié)果與分析

        2.1 釀酒酵母生長曲線

        取釀酒酵母斜面菌種1支,無菌操作接入YEPD培養(yǎng)液中,在30℃下恒溫培養(yǎng)24h,制成種子培養(yǎng)液。用2mL無菌移液管準(zhǔn)確吸取2mL種子培養(yǎng)液加入三角瓶中,于30℃下振蕩培養(yǎng)。然后分別對培養(yǎng)時間為0h,2h,4h,6h,8h,10h,12h,14h,16h的培養(yǎng)液測定OD值。釀酒酵母生長曲線見圖1。

        圖1 釀酒酵母生長曲線

        由圖1可明顯觀察到釀酒酵母菌體細(xì)胞生長出現(xiàn)3個階段:延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期。生長曲線直觀地反映了該菌群在培養(yǎng)過程中的生長、繁殖規(guī)律,該菌群在培養(yǎng)0~3h為延滯期,3~10h為對數(shù)生長期,10~16h為穩(wěn)定期。

        在對數(shù)生長期,酵母菌活菌數(shù)目以穩(wěn)定的幾何指數(shù)增長。此期間菌落形態(tài)、生物活性、染色都很典型,對環(huán)境因素的作用很敏感,因此選擇本實驗的紫外誘變在此期間進(jìn)行。

        在穩(wěn)定期,生長菌群總數(shù)處于基本平穩(wěn)階段,但細(xì)胞群體活力變化很大。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗、pH值下降、毒性產(chǎn)物積累等不利因素的影響,菌落染色、形態(tài)、生物活性出現(xiàn)改變,菌體開始產(chǎn)生代謝產(chǎn)物,有利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。

        2.2 釀酒酵母的誘變

        2.2.1 菌懸液的制備

        取已培養(yǎng)的24h的活化釀酒酵母斜面一支,用10mL生理鹽水將菌苔洗下,倒入試管中強烈振蕩10min,打碎菌塊,離心(1 000r/min)5min,棄上清液,將菌體用無菌水重復(fù)洗滌2次,最后制成菌懸液,使用XB-K-25型的血球計數(shù)板在顯微鏡下對酵母菌的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測定,并調(diào)整細(xì)胞濃度為107~108個/mL。血球計數(shù)板(規(guī)格25×16)測定酵母菌細(xì)胞數(shù)的計算公式為

        2.2.2 誘變

        取菌懸液加入到6cm培養(yǎng)皿中,放入無菌磁力攪拌棒在距離10W紫外燈30cm處邊照射邊攪拌。誘變時間分別為2min,3min。關(guān)閉紫外燈,在黑暗中放置5min。

        2.2.3 培養(yǎng)

        取誘變后的菌懸液1mL用生理鹽水稀釋10倍,取2.5mL進(jìn)行涂板。將紫外誘變后的釀酒酵母菌株和初始釀酒酵母菌株分別在35℃,37℃,40℃條件下進(jìn)行培養(yǎng),其長勢情況見表1。

        表1 初始菌株和誘變菌株不同培養(yǎng)溫度下的生長情況

        由表1可知初始釀酒酵母菌株在35℃,37℃條件下長勢明顯變?nèi)?,?0℃的高溫下無菌落長出,說明高溫破壞了菌體酶的活性,不利于菌株的生長。經(jīng)紫外誘變的菌株在35℃,37℃條件下長勢明顯好于初始菌株,且誘變3min的長勢明顯優(yōu)于誘變2min的長勢,說明誘變時間長,菌株的致死率相對較高,產(chǎn)生的變異效果明顯。

        2.3 釀酒酵母的發(fā)酵實驗與酒精含量測定

        2.3.1 釀酒酵母發(fā)酵實驗

        在無菌操作臺內(nèi)用接種環(huán)分別挑兩環(huán)初始菌株、誘變2min的菌株和誘變3min的菌株至YEPD培養(yǎng)基中,分別放入溫度為35℃,37℃,40℃培養(yǎng)箱中先120r/min的振蕩培養(yǎng)18h,后靜置培養(yǎng)54h。

        2.3.2 酒精度測定

        取以上各發(fā)酵液150mL,加入少量沸石進(jìn)行蒸餾,收集餾出液。用酒精計測定其酒精度。將菌株進(jìn)行編號,字母A代表誘變時間為2min的菌株,B代表誘變時間為3min的菌株,阿拉伯?dāng)?shù)字1代表35℃,2代表37℃,3代表40℃。酒精度的測定結(jié)果見表2。

        表2 初始菌株及誘變菌株發(fā)酵酒精度的測定

        由表2可知初始菌株,在35℃和37℃高溫條件下其發(fā)酵能力明顯下降。而誘變時間3min,誘變溫度37℃的菌株發(fā)酵能力最強,其成熟醪酒精的體積分?jǐn)?shù)可達(dá)3.837%;誘變時間3min,誘變溫度為35℃的菌株發(fā)酵能力次之,其成熟醪酒精的體積分?jǐn)?shù)為3.571%。結(jié)果表明,釀酒酵母經(jīng)誘變3min可適應(yīng)37℃的較高溫度,且具有較高的產(chǎn)酒率,故B2菌株為本實驗篩選目的菌株。因此,通過紫外誘變成功選育出了一株耐高溫、高酒精產(chǎn)率的釀酒酵母菌株。

        3 結(jié)論

        本實驗采用紫外誘變方法,誘變篩選耐高溫、高產(chǎn)酒率的釀酒酵母。該方法簡單易行,且有較高的誘變效率。利用紫外分光光度法測定菌株濃度,繪制出釀酒酵母生長曲線,由此選擇了最佳的菌株誘變菌齡為3~10h,以此提高誘變得率。紫外線誘變的條件為:紫外燈功率10W;照射距離30 cm,照射時間3min。此條件下篩選出了一株耐37℃高溫,酒精產(chǎn)率為3.837%的釀酒酵母菌株。

        [1] 章克昌.發(fā)展“燃料酒精”的建議[J].中國工程科學(xué),2002,2(6):89-93.

        [2] 馬曉建,孫鳳杰,劉龍飛.降低燃料乙醇生產(chǎn)成本若干問題的分析[J].河南化工,2003(9):4-7.

        [3] 池振明.高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1995(4):80-85.

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