黃利，葛婷，夏蘊(yùn)瓊，楊錦強(qiáng)，鄭云楓*，朱立靜，劉將

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210029；2.上海華源安徽錦輝制藥有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236018)

HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定丹參注射液中4種糖類成分的含量△

黃利1，葛婷1，夏蘊(yùn)瓊2，楊錦強(qiáng)1，鄭云楓1*，朱立靜1，劉將2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210029；2.上海華源安徽錦輝制藥有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236018)

目的：建立丹參注射液中果糖、葡萄糖、甘露三糖和水蘇糖4種糖類成分的HPLC-ELSD分析測(cè)定方法。方法：采用Prevail Carbohydrate ES(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-水(67∶33)為流動(dòng)相，體積流量為1.0 mL·min-1；ELSD漂移管溫度90 ℃，載氣為空氣，載氣流量為3.0 L·min-1；柱溫為35 ℃。結(jié)果：果糖、葡萄糖、甘露三糖和水蘇糖的線性范圍分別為375.6～187 8，233.0～116 5，228.4～114 2，300.2～1 501 μg·mL-1，平均回收率分別為102.4%，103.9%，103.1%，100.9%，RSD分別為2.18%，3.45%，2.56%，2.71%。結(jié)論：該方法具有準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于丹參注射液的質(zhì)量控制。

HPLC-ELSD；丹參注射液；糖類

丹參注射液是臨床常用于治療冠心病、心絞痛的中藥注射劑之一，具有活血化瘀、理氣開(kāi)竅之功效[1]。已有研究表明，丹參注射液中除了含有酚酸類活性成分外，還含有含量較高的單糖及低聚糖類成分[2-5]。糖類化合物雖不是活血化瘀的有效成分，但直接影響著注射液滲透壓、固體量等重要參數(shù)。因此在控制丹參注射液中酚酸類成分的前提下，應(yīng)進(jìn)一步明確其含有的糖類成分含量，以保證其質(zhì)量可控及制劑安全。為此，課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)《中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)》相關(guān)要求，采用HPLC-ELSD法建立了同時(shí)測(cè)定丹參注射液中4種糖類成分的含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示本法準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，可以用于丹參注射液的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 HPLC色譜系統(tǒng)，Alltech ELSD 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，HS色譜數(shù)據(jù)工作站V4.0+(Waters公司)；AE240型電子分析天平(瑞士Mettler)。

1.2 試藥

果糖(批號(hào)：100231-200303)、葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：110833-200904)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甘露三糖對(duì)照品(批號(hào)：021654)、水蘇糖對(duì)照品(批號(hào)：851787)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。乙腈為色譜純，水為亞沸蒸餾水，其余試劑均為分析純。

丹參注射液為市售品(江西桔都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100114，規(guī)格：10 mL/支；江蘇神龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：090710，規(guī)格：2 mL/支；正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：091293，規(guī)格：10 mL/支)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES(250mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)(67∶33)，進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1，ELSD漂移管溫度：90 ℃，載氣為空氣，載氣流量：3.0 L·min-1，柱溫：35 ℃。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

A.江蘇神龍藥業(yè)；B.江西桔都藥業(yè) C.正大青春寶藥業(yè)；D.混合對(duì)照品1.果糖 2.葡萄糖 3.甘露三糖 4.水蘇糖圖1 不同企業(yè)產(chǎn)丹參注射液中糖類成分的HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取果糖、葡萄糖、甘露三糖和水蘇糖對(duì)照品46.95，29.13，28.55，37.53 mg置25 mL量瓶中，用水溶解并加水至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含果糖1.878 mg、葡萄糖1.165 mg、甘露三糖1.142 mg及水蘇糖1.501 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別準(zhǔn)確移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0，2.0，3.0，4.0 mL于5 mL量瓶中，用水稀釋配制成不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取丹參注射液1 mL置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取5種系列混合對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)數(shù)值(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(μg·mL-1)對(duì)數(shù)值(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。以各對(duì)照品信噪比10∶1確定定量限(LOQ)，信噪比3∶1確定檢測(cè)限(LOD)，結(jié)果見(jiàn)表1，表明各糖類化合物在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 4種糖類化合物的線性回歸方程、定量限和檢測(cè)限

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，果糖、葡萄糖、甘露三糖和水蘇糖峰面積的RSD分別為1.78%，2.42%，1.94%，1.47%，說(shuō)明該方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別在0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣分析，果糖、葡萄糖、甘露三糖和水蘇糖峰面積的RSD分別為1.24%，1.84%，1.93%，1.60%，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)丹參注射液6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得果糖、葡萄糖、甘露三糖和水蘇糖含量的RSD分別為2.18%，1.98%，2.45%，1.95%。說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取丹參注射液，精密量取0.5 mL，共6份，2份為一組，按相當(dāng)于樣品含量的80%，100%，120%，分別精密加入上述4種對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。果糖的平均回收率為102.4%(RSD=2.18%)；葡萄糖的平均回收率為103.9%(RSD=3.45%)；甘露三糖的平均回收率為103.1%(RSD=2.56%)，水蘇糖的平均回收率為100.9%(RSD=2.71%)。

2.9 樣品測(cè)定

取3個(gè)批次不同企業(yè)生產(chǎn)的丹參注射液，每個(gè)批次取樣2份，分別按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，得供試品溶液。并按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定4種糖類成分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同企業(yè)生產(chǎn)丹參注射液中4種糖類成分含量測(cè)定結(jié)果 /mg·mL-1

3 討論

在檢測(cè)器參數(shù)的優(yōu)化方面，漂移管溫度及氣體流量是影響蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)色譜峰信噪比的主要因素，經(jīng)過(guò)優(yōu)選最終確定了漂移管溫度為90 ℃，載氣流量為3.0 L·min-1。

在流動(dòng)相系統(tǒng)選擇方面，分別采用甲醇-水、乙腈-水等溶劑洗脫，考察樣品中各成分的分離情況及檢測(cè)靈敏度，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明采用乙腈-水(67∶33)洗脫時(shí)，所測(cè)4種糖類成分色譜峰峰形、柱效和分離度均良好。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同企業(yè)生產(chǎn)的丹參注射液中所含4種糖類成分含量差異較大，正大青春寶藥業(yè)生產(chǎn)的丹參注射液中未能檢測(cè)到甘露三糖及水蘇糖成分，而另外兩個(gè)企業(yè)生產(chǎn)制劑中均能測(cè)到這4種成分。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，丹參中并不含有甘露三糖，其制劑中所含甘露三糖主要由水蘇糖轉(zhuǎn)化而來(lái)。據(jù)此我們推測(cè)，不同企業(yè)制劑中所含糖類成分差異的原因可能與其所用原藥來(lái)源及生產(chǎn)工藝不同有關(guān)。糖類成分雖不是丹參注射液發(fā)揮治療作用的有效成分，但該類成分的含量可部分反映其原料及生產(chǎn)工藝的狀況。因此，通過(guò)對(duì)丹參注射液中糖類成分的測(cè)定，將有助于其所使用原料及生產(chǎn)工藝的監(jiān)控，進(jìn)而保證其臨床應(yīng)用的安全有效。

[1] 張志華.丹參滴注液治療短暫性腦缺血發(fā)作64例療效分析[J].西部醫(yī)學(xué)，2004，16(1)：58.

[2] 何麗娜，楊軍，姜怡，等.丹參酮對(duì)培養(yǎng)PC12細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用[J].中國(guó)中藥雜志，2001，26(6)：413.

[3] 李婧，劉漢清，孫小芬.丹參注射液多成分定量測(cè)定和指紋圖譜研究[J].中成藥，2011，33(4)：553.

[4] 尹愛(ài)群，劉群，邱明豐.不同廠家復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA的含量測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31(20)：1729.

[5] 劉陶世，黃耀洲.丹參成分、制劑和質(zhì)量控制研究概況[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，14(4)：255.

[6] 鄭云楓，彭國(guó)平，程建明，等.丹參注射液中糖類化學(xué)成分及在生產(chǎn)工藝條件下的轉(zhuǎn)化[J].中成藥，2012，34(11)：2155.

DeterminationofFourSaccharidesinDanshenInjectionbyHPLC-ELSD

HUANG Li1, GE Ting1, XIA Xun-qiong2, YANG Jin-qiang1, ZHENG Yun-feng1*, ZHU Li-jing1, LIU Jiang2

(1.SchoolofPharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210029,China; 2.ShanghaiHuayuanAnhuiJinhuiPharmaceuticalCo.Ltd.,Fuyang236018,China)

Objective：To establish a simple and sensitive high-performance liquid chromatography coupled with evaporative light-scattering detector(HPLC-ELSD)method for the determination of four saccharides including fructose，glucose，mannotriose and stachyose in Danshen Injection.Methods：The HPLC method was conducted on a Prevail Carbohydrate ES column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with acetonitrile-water(67∶33)as mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1，the drift tube temperature of ELSD was set at 35 ℃，and carrier flow was 3.0 L·min-1. The column temperature was 35℃.Results：The calibration of fructose，glucose，mannotriose and stachyose were linear over the ranges of 375.6～187 8，233.0～116 5，228.4～114 2 and 300.2～150 1 μg·mL-1respectively，and the average recoveries were 102.4%(RSD，2.18%)，103.9%(RSD，3.45%)，103.1%(RSD，2.56%)，100.9%(RSD，2.71%)respectively.Conclusion：The method is accurate，simple and reproducible for quality control of Danshen Injection.

HPLC-ELSD； Danshen Injection； Saccharides

2013-03-12)

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江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(SBK201123752),南京中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新風(fēng)險(xiǎn)基金項(xiàng)目(CX201101)

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鄭云楓，Tel：(025)86798186；E-mail：zyunfeng88@126.com