白 林，郭興道，任 韡（. 解放軍總醫(yī)院藥品保障中心藥檢室，北京 00853；. 河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

感冒清熱顆粒是2010年版《中國藥典》收錄的品種，主要由荊芥穗、防風(fēng)、柴胡、葛根等11味中藥材組成[1]。對(duì)于感冒清熱顆粒中葛根素的含量測定，中國藥典已有規(guī)定，但其中荊芥穗和薄荷中總胡薄荷酮的鑒別及含量測定均未收載，尚無質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。目前，已有文獻(xiàn)[2]報(bào)道了測定感冒清熱顆粒中荊芥穗、薄荷中總胡薄荷酮的方法。薄荷和荊芥穗是感冒清熱顆粒中具有抗病原微生物[3]，解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛作用[4]的成分，我們采用HPLC法同時(shí)測定感冒清熱顆粒中葛根的主要有效成分葛根素、薄荷與荊芥穗中總胡薄荷酮的含量，獲得滿意效果。

1 儀器與試藥

CX-300型超聲波清洗機(jī)（北京市天海雙龍醫(yī)療器械有限責(zé)任公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，含自動(dòng)脫氣機(jī)、VWD檢測器、四元梯度泵和化學(xué)工作站）；UV-2550型紫外分光光度儀（日本島津）。

葛根素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-200209）；胡薄荷酮對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111706-201004）；甲醇為色譜純；水為重蒸水。

感冒清熱顆粒（廠家1，批號(hào)：1001171；廠家2，批號(hào)：0111428；廠家3，批號(hào)：EOF003；廠家4，批號(hào)：1001005；廠家5，批號(hào)：120103；廠家6，批號(hào)：101004；廠家7，批號(hào)：100861。規(guī)格均為每袋12 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫（0 ～ 10 min，甲醇濃度由20%遞升至40%；10 ～ 15 min，甲醇濃度由40%遞升至75%，15 ～ 20 min甲醇濃度由75%遞減至65%，20 ～ 30 min甲醇濃度遞減至20%），檢測波長252 nm；柱溫為40 ℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按胡薄荷酮峰計(jì)算不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取胡薄荷酮對(duì)照品約3.929 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度[5]，搖勻，即得胡薄荷酮儲(chǔ)備液（78.6 μg·mL-1）；取葛根素對(duì)照品約0.013 83 g，精密稱定，用30%乙醇溶解稀釋至25 mL[6]，搖勻，即得葛根素儲(chǔ)備液（553.2 μg·mL-1）。再取胡薄荷酮儲(chǔ)備液、葛根素儲(chǔ)備液各8 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得到含胡薄荷酮12.573 μg·mL-1、葛根素88.512 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取感冒清熱顆粒適量，研細(xì)，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照液 按處方比例稱取除葛根、荊芥穗、薄荷以外的其余藥味，按感冒清熱顆粒制備工藝制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，典型的色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液并以甲醇為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。含葛根素分別為5.532、11.064、22.128、44.256、88.512 μg·mL-1；含胡薄荷酮分別為0.786、1.572、3.143、6.286、12.573 μg·mL-1，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。葛根素Y= 38.445X+ 13.473，r= 1.000 0；胡薄荷酮Y= 29.912X- 1.808，r= 0.999 9。結(jié)果表明，葛根素在5.532 ～ 88.512 μg·mL-1、胡薄荷酮在0.786 ～12.573 μg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按上述色譜條件，精密吸取含葛根素為22.128 μg·mL-1、胡薄荷酮為3.143 μg·mL-1的對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄葛根素峰面積值分別為874.4，871.6，870.6，872.6，879.5，平均值為873.7，RSD為0.40%（n= 5）；胡薄荷酮峰面積值分別為81.5，81.5，81.7，80.8，82.8，平均值為81.7，RSD為0.89%（n= 5）。說明儀器的精密度良好。

圖1 感冒清熱顆粒中葛根素和胡薄荷酮的色譜圖

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取本品（批號(hào)0111428）粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件檢測，精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀，共進(jìn)樣5次，記錄葛根素峰面積值分別為1 845.6，1 882.2，1 855.7，1 804.5，1 801.1，平均值為1 837.8，RSD為1.89%（n= 5）；胡薄荷酮峰面積值分別為124.6，123.4，123.8，123.6，124.1，平均值為123.9，RSD為0.38%（n= 5）。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取本品（批號(hào)0111428）粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件，精密吸取供試品溶液10 μL，分別在0，4，8，12，16，24 h進(jìn)樣。記錄葛根素峰面積值分別為1 845.6，1 855.7，1 804.5，1 801.1，1 825.0，1 807.5，平均值為1 823.2，RSD為1.26%（n=6）；胡薄荷酮峰面積值分別為124.6，123.8，123.6，124.1，123.6，123.5，平均值為123.9，RSD為0.34%（n= 6）。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

2.8.1 葛根素回收率 取6份已知含量的感冒清熱顆粒（批號(hào)0111428）內(nèi)容物適量，研細(xì)，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入編號(hào)1 ～ 6的具塞錐形瓶中，分別精密加入0.4 mL葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度553.2 μg·mL-1），再精密加入19.6 mL甲醇，按供試品溶液制備方法，依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.73%，RSD為0.62%（n= 6）。具體見表1。

2.8.2 胡薄荷酮回收率 取6份已知含量的感冒清熱顆粒（批號(hào)0111428）內(nèi)容物適量，研細(xì)，每份約1.3 g，精密稱定，分別加入編號(hào)1 ～ 6的具塞錐形瓶中，分別精密加胡薄荷酮對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度0.078 58 mg·mL-1）0.4 mL，再精密加入19.6 mL甲醇，按供試品溶液制備方法，依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.78%，RSD為0.75%（n= 6）。具體結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定

分別取7個(gè)不同廠家的感冒清熱顆粒約1 g，精密稱定，用“2.2.2”方法制備，用“2.1”方法測定感冒清熱顆粒中葛根素和胡薄荷酮的含量；同時(shí)，采用本試驗(yàn)方法進(jìn)行感冒清熱顆粒中葛根素含量測定并與藥典[1]方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

表1 葛根素回收率實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果. n = 6Tab 1 Results of recovery test for puerarin. n = 6

表2 胡薄荷酮回收率實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果. n = 6Tab 2 Results of recovery test for pulegone. n = 6

表3 不同測定方法下7個(gè)廠家感冒清熱顆粒中葛根素和胡薄荷酮的含量測定結(jié)果Tab 3 Contents of puerarin and pulegone in ganmao qingre granules from seven pharmaceutical factories by different methods

3 討論

3.1 溶劑的選擇

2010年版《中華人民共和國藥典》中葛根素含量測定的提取溶劑為30%乙醇[1]，本實(shí)驗(yàn)供試品的提取溶劑分別采用30%乙醇和甲醇，并進(jìn)行比較，結(jié)果葛根素含量無明顯差異，考慮到胡薄荷酮在甲醇中溶解性好，故本實(shí)驗(yàn)供試品提取溶劑、胡薄荷酮對(duì)照品溶液以甲醇作為溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

取對(duì)照品溶液，在200 ～ 400 nm范圍內(nèi)掃描，胡薄荷酮和葛根素的最大吸收波長分別為252 nm和250 nm。由于感冒清熱顆粒中胡薄荷酮的含量比葛根素低，故采用252 nm作為測定波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇

我們對(duì)甲醇-水的比例分別為25∶75[7]、30∶70[8]、40∶60、50∶50[2]、65∶35、70∶30的流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果甲醇濃度較高時(shí)，葛根素出峰時(shí)間在2 min左右，與雜質(zhì)峰不能分離；甲醇濃度低時(shí)，胡薄荷酮在有效時(shí)間不出峰。綜合考慮，采用梯度洗脫，流動(dòng)相中甲醇的濃度先低后高，使葛根素、胡薄荷酮出峰時(shí)間分別在10 min和20 min左右，分離度好，靈敏度高。

3.4 葛根素和胡薄荷酮的含量

不同廠家的感冒清熱顆粒中葛根素與胡薄荷酮的含量差異顯著。2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定感冒清熱顆粒中的葛根以葛根素計(jì)，每袋不得少于10.0 mg。但本文結(jié)果中，不同廠家的葛根素含量為每袋10.553 5 ～ 26.162 0 mg，相差一倍以上；7個(gè)廠家中只有一個(gè)廠家的感冒清熱顆粒中有胡薄荷酮的成分。葛根素與胡薄荷酮的含量受產(chǎn)地、采收季節(jié)、儲(chǔ)存時(shí)間、加工工藝等多因素影響，可能導(dǎo)致不同廠家生產(chǎn)的藥品有效成分含量差異顯著。成分含量的差異會(huì)導(dǎo)致不同廠家的產(chǎn)品之間臨床療效的差異。而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于胡薄荷酮既無鑒別又無含量測定方法，也是導(dǎo)致質(zhì)量差異較大的原因。因此，應(yīng)逐步完善和加強(qiáng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

本試驗(yàn)方法同時(shí)測定了葛根中的葛根素和薄荷與荊芥中的胡薄荷酮的含量，作為檢測感冒清熱顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具有較好的臨床意義。經(jīng)比較，本法與藥典方法測定葛根素含量的差異不大，為感冒清熱顆粒的質(zhì)量檢測提供了一種簡便、有效的方法。

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