劉海旺，李春輝△，李建玲

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.病理科；2.麻醉科，河北承德 067000）

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在我國各類腫瘤中居首位，但胃癌的發(fā)病機制目前尚未完全明確，因此胃癌發(fā)病機制的研究就成為了目前的研究重點。縫隙連接是相鄰細胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由胞膜上的縫隙連接蛋白（con-nexin，Cx）構(gòu)成，其中包括Cx43，細胞通過它所介導的細胞縫隙連接通訊（gap junction intercellular communication，GJIC）進行細胞間信息和能量的傳遞，調(diào)控細胞的生長、分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而在胃腫瘤細胞中存在Cx的異常表達，可能使得腫瘤細胞生長速度加快，增值能力增強，與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移也有密切的聯(lián)系。本研究通過免疫組織化學染色方法觀察Cx43在胃癌組織和正常胃組織中的表達情況，并通過分析其表達方式與臨床病理特征的關(guān)系，進一步探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院2010年9月至2012年2月手術(shù)切除經(jīng)病理證實為胃癌組織60例及正常胃組織25例，常規(guī)取材固定于中性甲醛液后，逐級脫水石蠟包埋，用于免疫組織化學法染色。60例胃癌患者中，男48例，女12例；年齡45～77歲，平均（58.5±10.0）歲。高、中分化者24例，低分化者36例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例；Ⅰ＋Ⅱ期28例，Ⅲ＋Ⅳ期32例。25例正常胃組織來自本院健康體檢者，其中男16例，女9例；年齡46～72歲，平均（60.0±6.0）歲。

1.2 試劑與儀器 一抗兔抗人多克隆Cx43抗體（ZA-0444）購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，抗體稀釋倍數(shù)為1∶100，二抗為快捷型酶標羊抗鼠／兔IgG聚合物，DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司（DAB-0031），二甲苯、乙醇、3%H2O2、枸櫞酸鈉等常規(guī)試劑購自北京化學試劑公司。全自動脫水機（英國Shandon Thrmo公司），S325石蠟切片機（英國Shandon公司產(chǎn)品），G2X-DH-40X45電熱恒溫箱（山東立鶴公司產(chǎn)品），BX40F4顯微鏡（日本 Olympus公司產(chǎn)品），顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司產(chǎn)品）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學方法 標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片4μm，切片以二甲苯脫蠟及系列乙醇脫水；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5min，以3%H2O2孵育10min（室溫）；PBS沖洗2×6min后在微波爐中進行抗原修復；加Cx43抗體，在37℃濕盒中溫育60min后，在濕盒中4℃過夜；PBS洗3×5min，滴加二抗，室溫孵育15min；PBS洗3×5min，DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染核；封片，觀察。另外，組織切片用PBS替代Cx43抗體（其余染色步驟相同）作為陰性對照，用已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定方法 正常胃組織中Cx43陽性信號主要表達于細胞膜，在胃癌組織中可表達于細胞質(zhì)。在染色均勻的區(qū)域，選取5個高倍鏡視野（×400）：（1）按陽性細胞百分率（A值）評分：1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分；（2）按染色強度（B值）評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合A值與B值判斷結(jié)果，陰性（-）為0分，弱陽性（＋）為1～2分，中度陽性（＋＋）為3～4分，強陽性（＋＋＋）為5～6分。

1.4 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)通過SPSS17.0統(tǒng)計軟件完成，計數(shù)資料采用四格表χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cx43在正常胃組織和胃癌組織中的表達 正常胃組織中Cx43的陽性表達率為100%（25／25），明顯高于胃癌組織陽性表達率66.7%（40／60），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 胃癌組織中Cx43的表達與臨床病理的關(guān)系

圖1 高、中分化胃癌Cx43的表達（×100）

圖2 低分化胃癌Cx43的表達（×100）

2.2 胃癌組織中Cx43的表達與臨床病理特征的關(guān)系 高、中分化者Cx43的陽性表達率為83.3%（20／24）高于低分化者的陽性表達率55.6%（20／36），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Cx43的陽表達率為88.0%（22／25）高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達率51.4%（18／35），Ⅰ＋Ⅱ期 Cx43的陽性表達率為89.3%（25／28）高于 Ⅲ＋Ⅳ期的陽性表達率46.9%（15／32），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1，圖1、2。

3 討 論

縫隙連接是相鄰細胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由胞膜上的Cx構(gòu)成，細胞通過它所介導的GJIC進行細胞間信息和能量的傳遞，調(diào)控細胞的生長、分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對機體功能的維持發(fā)揮重要作用，胃癌的發(fā)生可能與 GJIC功能異常有關(guān)［1-2］。Cx43被認為是胃黏膜中的主要連接蛋白，連接蛋白的共同結(jié)構(gòu)由4個跨膜親水片段M1-4，為α螺旋結(jié)構(gòu)，2個胞外環(huán)E1-2和1個胞質(zhì)環(huán)，縫隙連接是通訊連接的主要形式，是溝通相鄰細胞的跨膜通道［3-4］。一些離子和相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)可以直接從一個細胞流入另一個細胞內(nèi)，這樣周圍的健康細胞便可以營養(yǎng)相鄰的病態(tài)細胞［5］?？p隙連接的功能除介導細胞之間的連接外，主要是偶聯(lián)細胞間通訊，包括電偶聯(lián)和化學偶聯(lián)［6］，大多數(shù)腫瘤細胞的縫隙連接通訊功能微弱或缺失，細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后其GJIC功能降低或抑制，被認為是促癌變階段的重要機制，Cx43主要表達在細胞膜上，當其表達異常，如表達于細胞質(zhì)時可能已經(jīng)發(fā)生了癌變［7］。Tang等［8］研究發(fā)現(xiàn)在胃腫瘤細胞中與鄰近的正常細胞相比Cx43顯著性的低表達，在有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中與胃腫瘤細胞相比Cx43顯著性的高表達，同時提出Cx43的低表達可能促成了胃癌的發(fā)生。但Cx43的高表達也可能促成了胃癌細胞高效的新陳代謝以至于發(fā)展到有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［9-11］。研究也發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞和血管內(nèi)皮間可有明顯的陽性著色，這表明腫瘤細胞可能利用間隙連接從血管中獲取營養(yǎng)物質(zhì)［12］。Cx43表達量的變化還可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Su等［13］應用Cx43轉(zhuǎn)染惡性黑色素瘤細胞株發(fā)現(xiàn)細胞的Cx43表達增強，貼壁依賴性生長受到了抑制，Cx43基因可上調(diào)腫瘤細胞Cx43mRNA的表達，促進磷酸化，恢復和增強GJIC功能，逆轉(zhuǎn)惡性表型，抑制腫瘤細胞增殖。同時也有研究認為縫隙連接的表達是腫瘤細胞浸潤的條件之一［14］。本實驗通過免疫組織化學法對Cx43在正常胃黏膜及胃癌組織中的表達進行研究，研究發(fā)現(xiàn)Cx43在正常胃黏膜中的表達明顯高于其在胃癌組織中的表達，高、中分化胃癌Cx43的表達均高于低分化胃癌組；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌Cx43的表達高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組，胃癌組織Ⅰ＋Ⅱ期Cx43的表達高于 Ⅲ＋Ⅳ期的表達。這一實驗結(jié)果與之前的某些研究結(jié)果一致［15］，進一步驗證了縫隙連接的異常表達與腫瘤的浸潤性生長能力較強有關(guān)。

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