鹿 強(qiáng)，臧愛民，馮樹明

（1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北保定 071000；2.河北省徐水縣婦幼保健院內(nèi)科，河北保定 072550）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，胃癌及癌前病變的發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟、多因素和多階段綜合作用的結(jié)果［1］。胃癌的發(fā)生、發(fā)展不僅與細(xì)胞的過(guò)度增殖有關(guān)，同時(shí)也和凋亡有密切關(guān)系［2］。第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）、細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑蛋白（P27kip1）是細(xì)胞周期調(diào)控因子的重要成分，檢測(cè)其在胃癌及癌前病變中的表達(dá)，旨在診治胃癌提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北大學(xué)附屬醫(yī)院2009年1月至2012年5月期間的50例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，癌旁正常組織50例及癌前病變18例，其中腸上皮化生8例、不典型增生10例，每例選取蠟塊4μm連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。癌旁組織距瘤緣約5cm，均經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)為正常組織作為對(duì)照。所有患者術(shù)前均未接受治療，新鮮組織采用手術(shù)分離立即置于10%中性甲醛中，常規(guī)石蠟包埋。本研究中50例胃癌組中男30例，女20例，年齡32～78歲，平均55歲；18例胃癌前病變組中男12例，女6例，年齡30～58歲，平均44歲。所有切片均按全國(guó)胃癌協(xié)作組提出的標(biāo)準(zhǔn)，由具有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理科主任醫(yī)師進(jìn)行復(fù)檢。

1.2 主要試劑 P27kip1鼠抗人單克隆抗體、兔抗人PTEN多克隆抗體（即用型）、光譜純?cè)噭⊿P）盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑試劑盒購(gòu)自北京新生物技術(shù)開發(fā)中心，免疫組化測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 組織切片常規(guī)HE染色，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，并根據(jù)中國(guó)抗癌學(xué)會(huì)胃癌分類（1990年）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胃癌病理學(xué)分型，分為高、中、低分化腺癌及黏液癌，其他分為腸上皮化生、不典型增生。組織標(biāo)本常規(guī)石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，每次3min。經(jīng)梯度乙醇脫水至二甲苯，中性樹脂封片，鏡下觀察結(jié)果。各步驟之間均以PBS洗3次，3min／次。每種抗體均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為已知表達(dá)陽(yáng)性的組織切片，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) PTEN、P27kip1蛋白以細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，染色結(jié)果以每張切片在400倍鏡下均觀察整體染色情況，選擇有代表性的區(qū)域，隨機(jī)讀取100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。切片中陽(yáng)性細(xì)胞率大于或等于5%為陽(yáng)性病例，小于5%為陰性病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)PTEN、P27kip1蛋白表達(dá)應(yīng)用χ2檢驗(yàn)和校正χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTEN在各組中表達(dá) PTEN正常胃黏膜組陽(yáng)性率98%，腸上皮化生組、不典型增生組陽(yáng)性率分別為75%、70%，胃癌組陽(yáng)性率58%，呈逐漸下降趨勢(shì)（P＜0.01）。見表1，圖1、2。

圖1 PTEN在正常胃黏膜中表達(dá)（SP×100）

圖2 PTEN在胃癌中表達(dá)（SP×100）

2.2 P27kip1在各組中表達(dá) P27kip1正常組陽(yáng)性率98%，腸上皮化生組陽(yáng)性率75%，不典型增生組陽(yáng)性率40%，胃癌組陽(yáng)性率38%，呈逐漸下降趨勢(shì)（P＜0.01）。見表2，圖3、4。

表2 P27kip1在各組中表達(dá)

圖3 P27kip1在正常胃黏膜中表達(dá)（SP×100）

圖4 P27kip1在胃癌中表達(dá)（SP×100）

2.3 胃癌病理組織不同類型PTEN、P27kip1的表達(dá) PTEN的陽(yáng)性率在胃癌高中分化、低未分化、黏液癌中分別為80.00%、57.7%、22.22%，組間卡方檢驗(yàn)P=0.021，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P27kip1的陽(yáng)性率在胃癌高中分化、低未分化、黏液癌分別為13.3%、50%、55.55%，組間卡方檢驗(yàn)P=0.037，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 胃癌病理組織不同類型PTEN、P27kip1的表達(dá)

2.4 胃癌中PTEN和P27kip1之間的表達(dá)關(guān)系 50例胃癌患者中PTEN和p27kip1表達(dá)的具有正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.975，P＜0.05），見表4。

表4 胃癌中PTEN與p27kip1的表達(dá)關(guān)系（n）

3 討 論

3.1 PTEN表達(dá)與胃癌的關(guān)系 PTEN是1997年由3個(gè)研究小組克隆到的新的腫瘤抑癌基因［3］，是位于人染色體10q23.3的抑癌基因。實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞質(zhì)、核膜及核內(nèi)都有表達(dá)［4］，其編碼產(chǎn)物為403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，通過(guò)使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸去磷酸化而抑制磷脂酰肌醇-3激酶依賴的蛋白激酶B（Akt），導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素［5］。當(dāng)PTEN抑癌基因突變或缺失可能構(gòu)成一個(gè)新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［6］，PTEN蛋白高表達(dá)的胃癌細(xì)胞系，其黏附和遷移能力顯著降低，目前認(rèn)為PTEN可能通過(guò)降低細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和血管形成而參與胃癌演進(jìn)，在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要的作用［7］。

本研究結(jié)果PTEN在胃正常組織、腸上皮化生、不典型增生、胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率呈逐漸下降趨勢(shì)，與Yang等［8］的研究結(jié)果相近似，正常胃黏膜及腸化生組織中的PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于不典型增生及胃癌組織。

PTEN低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞更易浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，因而侵襲性強(qiáng)、惡性度高、預(yù)后差［9］，本研究結(jié)果PTEN陽(yáng)性率與胃癌組織類型密切相關(guān)，胃高中分化腺癌組織中PTEN陽(yáng)性率明顯高于胃低分化腺癌組織，有顯著差異，這可能是基因水平改變的結(jié)果，提示PTEN的檢測(cè)，可能為判斷胃癌患者的惡性程度及預(yù)后提供依據(jù)。相關(guān)研究表明PTEN的表達(dá)與患者3年生存率相關(guān)，表達(dá)缺失者生存率低，是影響胃癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)之一［10］。

3.2 P27kip1表達(dá)與胃癌的關(guān)系 P27kip1是細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑（CDKIs）家族成員之一，P27kip1主要定位于胞核，但在胞漿和胞核中均有表達(dá)［11］，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，低表達(dá)加速腫瘤細(xì)胞合成增多，促使腫瘤發(fā)展［12］，P27kip1對(duì)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控作用主要是通過(guò)抑制CDKIs復(fù)合物的激活或抑制已激活的CDKIs復(fù)合物的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，使得細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，從而調(diào)控著細(xì)胞的生存與增殖。目前研究證實(shí)在多種腫瘤組織中存在P27kip1的異常表達(dá)［13］，它不但直接調(diào)控細(xì)胞周期，還作為胞外刺激信號(hào)的潛在媒介來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲密切相關(guān)。

本研究結(jié)果P27kip1在胃癌、腸上皮化生、不典型增生（P＜0.01）低表達(dá)較顯著，在胃癌高、中、低、未分化、黏液腺癌表達(dá)（P＜0.05），提示P27kip1表達(dá)下調(diào)可能影響胃癌分化程度及侵襲能力，與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度呈負(fù)相關(guān)，這一研究結(jié)果與Ohtani等［14］研究發(fā)現(xiàn)P27kip1基因缺失導(dǎo)致的P27kip1蛋白表達(dá)缺失，與胃癌進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)一致。

3.3 胃癌中PTEN與p27kip1表達(dá)的關(guān)系 本研究結(jié)果表明在胃癌中PTEN的表達(dá)與P27kip1表達(dá)呈正相關(guān)，PTEN低表達(dá)可降低P27kip1表達(dá)。P27kip1是PTEN調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的下游信號(hào)分子，PTEN可以使P27kip1去磷酸化，降低其在細(xì)胞中的分解代謝水平，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期［15］，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，PTEN和P27kip1可能起著協(xié)同的作用，PTEN和P27kip1的表達(dá)可作為診斷胃癌的一個(gè)重要依據(jù)。

綜上所述，該檢測(cè)PTEN、P27kip1蛋白表達(dá)下調(diào)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展方式呈正相關(guān)，對(duì)胃癌的早期診斷、治療、判斷預(yù)后提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要指導(dǎo)意義。

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