亞紅祥，王靜林

恙蟲病（tsutsugamushi disease）又稱叢林斑疹傷寒（scrub typhus），是由恙蟲病東方體（Oreintia tsutsugamushi，Ot）引起的急性傳染病，該病常引起多器官損害，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，容易誤診［1］。云南為恙蟲病的主要流行省份，近年恙蟲病病例增多［2］。國際上恙蟲病已被認(rèn)為是威脅旅游健康的重要傳染病之一，隨著云南生態(tài)旅游的日益發(fā)展，該病已成為我省一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。為了明確我省恙蟲病病原體的類型，我們應(yīng)用血清學(xué)方法對(duì)云南大理地區(qū)恙蟲病病例進(jìn)行血清學(xué)診斷，并對(duì)病原體做基因序列分析。

1 材料與方法

1．1 材料 2010年2月—12月收集到當(dāng)?shù)馗麽t(yī)療機(jī)構(gòu)送檢的云南大理地區(qū)不明原因持續(xù)發(fā)熱≥3天的病人血液19份，每份樣本取一部分全血進(jìn)行低速離心分離血清用于血清抗體檢測(cè)，另一部分全血用于核酸提取。

1．2 方法

1．2．1 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）用PBS從1∶20開始對(duì)被檢樣本血清作系列稀釋至1∶320，將各稀釋度血清分別加到Ot Karp型和Kato型抗原片（中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供）孔內(nèi)，放入濕盒置37℃孵育45min，用PBS洗片3次，每次1～2min，吹干，加入熒光素標(biāo)記的羊抗人IgG抗體（KPL公司），放入濕盒置37℃孵育30min，用PBS洗片3次，每次1～2min，吹干，用Nikon熒光顯微鏡觀察結(jié)果。熒光明亮，呈黃綠色，病原體均勻分布，即可判定該滴度為陽性。

1．2．2 巢式PCR（nPCR）檢測(cè) 用 QIAGEN 公司DNA提取試劑盒對(duì)患者血液提取總DNA，應(yīng)用文獻(xiàn) 中的引物（表1）及條件對(duì)Ot groEL 和sta56基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)總體積為25μL，應(yīng)用Promega公司 Go－TaqGreen Master Mix試劑盒在Biometra TProfessional PCR儀中進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，以無菌水作為陰性對(duì)照，無陽性對(duì)照。第一次擴(kuò)增時(shí)取6μL被檢標(biāo)本DNA為模板，第二次擴(kuò)增時(shí)取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物1μL作為模板。取二次PCR產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，DNA標(biāo)準(zhǔn)為DL2000（Takara公司）。

1．2．3 DNA序列測(cè)定及分析 PCR陽性產(chǎn)物送北京博邁德科技發(fā)展有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將所得到的序列通過Internet網(wǎng)進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心（www．ncbi．nlm．nih．gov）站點(diǎn)后，利用BLAST工具以及采用DNAStar中的MegAlign軟件對(duì)序列進(jìn)行同源性比較，運(yùn)用MEGA5．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 Ot檢測(cè)所用引物序列Tab．1 Primers’sequences for detection of Ot

2 結(jié) 果

2．1 病例資料 收集到病例19份資料（編號(hào)DL1－19），均有不明原因發(fā)熱，發(fā)熱時(shí)間在3～24d，體溫在38～41℃，伴有全身酸痛7例、焦痂2例（DL1患者左腿腘窩處焦痂，見圖1），有的還伴咳嗽、咳痰、鼻出血、胃出血、尿少等；其中農(nóng)民15例、學(xué)生2例、其他2例，男：女性別為11／8，年齡在8～63歲。

2．2 IFA檢測(cè) 對(duì)19例患者血清進(jìn)行Ot IgG抗體檢測(cè)，以效價(jià)1∶40作為陽性參考值，結(jié)果Karp型陽性7例，效價(jià)在1∶160－1∶40；Kato型陽性4例，效價(jià)在1∶320－1∶40；兩型均陰性11例；兩型均陽性3例，其中DL1樣本兩型效價(jià)均達(dá)1∶160（表2）。

圖1 特異性焦痂Fig．1 Specific eschar

2．3 groEL基因檢測(cè)及序列分析 對(duì)19例患者血液進(jìn)行nPCR Ot groEL 基因檢測(cè)，結(jié)果 DL1、DL4和DL5共3份擴(kuò)增到364bp大小的目的片斷（圖2和表2）。

圖2 nPCR擴(kuò)增groEL片斷部分結(jié)果Fig．2 Partial result of nPCR detection by Ot groELsegment specific primersM：DL2000DNA marker；1：DL1；2：DL2；3：DL3；4：DL4；5：DL5；6：DL6；7：DL7；8：DL8；9：DL9；10：DL10．

表2 Ot抗體及groEL片斷檢測(cè)結(jié)果Tab．2 Detection results for Ab and groELsegment of Ot

從DL1、DL4和DL5樣本中擴(kuò)得的Ot groEL基因測(cè)序，將其序列進(jìn)行比較，結(jié)果3者之間的同源性為100%。

應(yīng)用BLAST工具將該測(cè)定序列（321bp）與GenBank中已知序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果該序列與 AH－GD－OT－S6（GQ499933）、Karp （M31887）、ZJ－TT－OT－O21（GQ499953）、UT332（EF551306）的同源性均為100%；與Kato（AY191586）的同源性為99%； 與 Kawasaki （AY191587）、 Gilliam（AY191585）的同源性分別為94%、93%。

2．4 sta56基因檢測(cè)及序列分析 對(duì)DL1樣本應(yīng)用群特異引物nPCR檢測(cè)Ot sta56基因，結(jié)果擴(kuò)增到481－507bp大小的目的片斷，應(yīng)用BLAST工具將測(cè)序獲得的樣本DL1序列（459bp）與GenBank中已知序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果DL1序列與臺(tái)灣株 KM05（GU120150）、HL04（GU120144）、TW45R（AY222632）、 KM17－2 （GU446600） KM18（GU446601）的同源性最高均為99%；與Karp株（M33004）的同源性為93%；與中國山東Shandong－XDM2（DQ514320）、TWZ（JX202573）株的同源性均為78%，與Kato（M63382）株的同源性為77%。

對(duì)DL1樣本應(yīng)用分型引物nPCR檢測(cè)Ot sta56基因，結(jié)果擴(kuò)增到230bp大小的Karp型sta56基因目的片斷（圖3），應(yīng)用BLAST工具將測(cè)序獲得的樣本DL1序列與GenBank中已知序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果 DL1序列（216bp）與臺(tái)灣株 KM05（GU120150）、HL04（GU120144）、TW45R（AY222632）、KM17－2（GU446600）KM18GU446601的同源性均為100%，與Karp株（M33004）的同源性為91%。

圖3 分型引物nPCR檢測(cè)DL1樣本結(jié)果Fig．3 Results of DL1by nPCR with Karp and Kato specific primersM：DL2000DNA marker；1：Karp；2：Kato

2．5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 根據(jù)Ot groEL 基因部分序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示樣本DL1序列（321bp）與 AH－GD－OT－S6（GQ499933）、Karp（M31887）、ZJ－TT－OT－O21（GQ499953）、UT332（EF551306）、Kato（AY191586）株在同一個(gè)分支上（圖4）。

根據(jù)Ot sta56基因部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析，結(jié)果顯示樣本DL1序列（據(jù)群特引物檢測(cè)Ot sta56片斷所獲得459bp大小的序列）與臺(tái)灣KM05（GU120150）、HL04（GU120144）、TW45R（AY222632）、 KM17－2 （GU446600）、 KM18（GU446601）株在同一個(gè)分支上，見圖5。

圖4 根據(jù)Ot groEL基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．4 Phylogenetic tree of partial segments of Ot groELgene

圖5 根據(jù)Ot sta56基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．5 Phylogenetic tree of partial segments of Ot sta56gene

2．6 恙蟲病病例診斷 根據(jù)恙蟲病預(yù)防控制技術(shù)指南［7］，結(jié)合患者臨床發(fā)病情況和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，恙蟲病患者共8例：其中實(shí)驗(yàn)室確診4例（其中2例Ot核酸陽性且抗體效價(jià)≥1∶160、1例Ot核酸陽性且抗體效價(jià)1∶40、1例Ot抗體效價(jià)1∶160）、臨床診斷病例4例（Ot抗體效價(jià)在1∶80～1∶40）；Karp血清型4例、Kato血清型3例、Karp＋Kato血清型1例；農(nóng)民7例、學(xué)生1例；春季3例、夏季2例、秋季2例、冬季1例。

3 討 論

恙蟲病是由恙蟲病東方體引起的自然疫源性疾病，以鼠類為主要傳染源，經(jīng)恙螨叮咬而傳播，臨床上以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大及皮疹為特征，全身毒血癥狀可致多臟器受累，甚至死亡［8］。恙蟲病在我國分布廣泛，近年全國流行態(tài)勢(shì)呈上升趨勢(shì)［9］。云南作為恙蟲病流行的主要省份之一，其病例也在逐年增多，主要分布于保山、大理、西雙版納等滇西南地區(qū)，全年均有發(fā)病，以夏秋季為主，農(nóng)民居多，且高度散發(fā)，誤診率高達(dá)80%［2］。以往多采用血清學(xué)方法對(duì)Ot進(jìn)行鑒定，近年許多省份和地區(qū)均有應(yīng)用RFLP、PCR技術(shù)及核苷酸序列分析等技術(shù)對(duì)Ot進(jìn)行基因序列鑒定［9］，然而云南對(duì)Ot的研究較少，特別是型別鑒定及序列分析尤為滯后。本次采用WHO推薦的恙蟲病標(biāo)準(zhǔn)診斷方法IFA［10］以及nPCR與序列分析技術(shù)進(jìn)行恙蟲病病例診斷，確診恙蟲病8例。其中2例有特異性焦痂，占總病例的25%，低于以往本省恙蟲病焦痂發(fā)生率30～80%［2］；8例確診恙蟲病病例中7例患者為農(nóng)民，符合該病以農(nóng)民居多的特點(diǎn)；春季3例、夏季2例、秋季2例、冬季1例，這也符合本省恙蟲病全年均有發(fā)病的特點(diǎn)。以往研究顯示大理地區(qū)恙蟲病患者以Karp血清型多見、Kato血清型甚少［11］，而本次研究發(fā)現(xiàn)該地區(qū)8例確認(rèn)的恙蟲病中，Karp血清型4例和Kato血清型3例，Karp＋Kato混合血清型1例。該結(jié)果說明大理地區(qū)存在Karp和Kato血清型恙蟲病東方體，以及可能某些患者為Karp和Kato血清型恙蟲病東方體的混合感染。

Ot 58kD蛋白較為保守，其編碼基因groEL常用于Ot的篩查，而56kD蛋白具有型或株特異性，sta56為其編碼基因通常應(yīng)用于Ot的型別鑒定。本次研究通過nPCR檢測(cè)到groEL基因目的片斷3例（檢出率15．79%，同時(shí)它們的Ot抗體也檢測(cè)陽性），序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該3株Ot均與Karp、AH－GD－OT－S6 （GQ499933）、ZJ－TT－OTO21、UT332、Kato株在同一個(gè)分支上，表明該方法不能區(qū)分出Ot的血清型別。從Karp＋Kato混合血清型樣本擴(kuò)得sta56基因片斷，其序列（216bp）分析結(jié)果表明該Ot株的遺傳進(jìn)化關(guān)系與臺(tái)灣KM05、HL04、TW45R、KM17－2、KM18株最為密切，而與Karp株的關(guān)系較遠(yuǎn)；群引物檢測(cè)到sta56基因片斷，其序列（459bp）系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該Ot株與臺(tái)灣 KM05、HL04、TW45R、KM17－2、KM18株在同一個(gè)分支上，而與Karp株不在同一分支，再次表明該Ot株的遺傳進(jìn)化關(guān)系與臺(tái)灣KM05、HL04、TW45R、KM17－2、KM18株最為密切，與 Karp株關(guān)系較遠(yuǎn)。

云南省大理地區(qū)為我國旅游勝地，該地區(qū)地形地貌復(fù)雜、植被豐富、鼠類和恙螨繁多［12－13］，是恙蟲病流行較為嚴(yán)重的地區(qū)，人們深受該病的危害。隨著當(dāng)?shù)芈糜螛I(yè)等人類活動(dòng)的日益擴(kuò)張，可致使一些恙蟲病疫源地的微環(huán)境發(fā)生改變，Ot可能發(fā)生一定的基因變異而出現(xiàn)新的基因型，使恙蟲病的流行可能呈現(xiàn)更為復(fù)雜多樣化，不僅對(duì)旅游健康構(gòu)成威脅，而且會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響。因此為了加強(qiáng)當(dāng)?shù)仨οx病的預(yù)防與控制，開展Ot的基因型別、毒力及其遺傳特征等方面的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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