陳 峰，吳爾翔，丁鎖順，邵亞平，章 杰，唐曉宇

志賀菌是一種常見人獸共患病原菌，在公共衛(wèi)生學領域十分重視［1－2］。志賀菌屬于常見且重要的腸道致病菌，易引起人類的食物中毒，導致相應的消化道癥狀，且易于傳播，因此早期的檢測、治療并控制傳染源有著重要意義［3］。目前臨床針對志賀菌的檢測仍采取細菌培養(yǎng)鑒定，抗原、抗體的血清免疫學檢查為主的方式。由于病原微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定、分型、標記等檢測過程繁瑣，不能滿足臨床的需要。因此建立快速、敏感且特異性高的志賀菌檢測方法非常必要，可有效地預防該病，控制疾病的傳播［4］。本研究根據(jù)志賀菌的ipaH基因序列為模板，設計引物和探針，應用熒光定量PCR法，特異性檢測的志賀菌，以便為進一步應用于志賀菌快速檢測法的建立奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 福氏志賀菌購于中國菌種保藏中心；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、腸球菌為實驗室分離鑒定后的保存菌株。

1．1．2 實驗材料 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；PCRMix、Taq酶、dNTP、基因組 DNA提取試劑盒購于TaKaRa公司。

1．1．3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank公布的福氏志賀菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer軟件設計PCR引物，上游引物F1：5′－GCTCTCCACTGCCGTGAAGG－3′，下游引物 R1：5′－AGTACAGCATGCCATGGTCC－3′，引物序列由上海英駿公司合成。二聚體蝎型探針的上游引物F2、標記的熒光報告基團的核苷酸鏈由hexethylene glyco1（HEG）連接如下，5′－FAM－CCGACACGCCATAGAAACGC－HEG－AGCTCTCCACTGCCGT

GAAGG－3′，標 記 猝 滅 基 團 的 互 補 鏈 為 5′－GCGTTTCTATGGCGTGTCGG－DABCYL－3′， 下游引物 R2：5′－ATAGCTTCGGCAGTGCGGAGG－3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成方法。

1．2．1 志賀菌重組標準品的制備

1．2．1．1 細菌DNA提取 接種菌落于瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12～16h；刮取1～2接種環(huán)菌苔加入100μL三蒸水中，混勻，100℃煮沸10min；12 000 r／min離心10min，取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．1．2 PCR 反應體系總體積25μL：10×Buffer：2．5μL；MgCl2：2．0μL；dNTP mix（10mmol／L）：2．0μL；F1（10μmol／L）：1．0μL；R1（10μmol／L）：1．0μL；DNA：5．0μL；Taq DNA 聚合酶：0．5 μL；ddH2O：11μL。反應條件：94℃變性10min，30個循環(huán)（94℃10min，94℃1min，55℃1min，72℃65 s），72℃延伸10min。

1．2．1．3 pMDl8－T－ipaH 重組質(zhì)粒的構建 PCR擴增片段經(jīng)1．5%糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的片段，用DNA連接試劑盒16℃過夜連接經(jīng)PCR擴增回收的目的片段和質(zhì)粒pMDl8－T，將連接產(chǎn)物轉化大腸埃希菌H5α后涂在氨芐青霉素（Amp＋）的1．5%瓊脂LB平板。

1．2．1．4 pMDl8－T－ipaH 重組質(zhì)粒的鑒定 挑取少量菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，100℃水浴5 min，立即置于冰上，12 000r／min離心10s，吸取上清行PCR擴增反應，擴增產(chǎn)物酶切后，使用1．5%瓊脂糖凝膠電泳。取鑒定后篩選出的陽性克隆重組質(zhì)粒，送至上海英駿公司測序并鑒定。

1．2．2 標準曲線繪制 將上述各已知濃度的重組質(zhì)粒DNA標準品分別按10倍梯度稀釋，獲得8個濃度的系列標準品，濃度分別為108～101copies／μL，后以每個濃度的標準品為模板，行實時定量PCR反應，濃度的對數(shù)為X軸，相對應的閾值循環(huán)數(shù)（threshold cycle，Ct）為 Y 軸，經(jīng)軟件處理得標準曲線。

1．2．3 實時定量PCR檢測體系的建立 在20μL反應體系中，加入1μLDNA，二聚體蝎型探針上游引物F22μL，淬滅鏈2μL，下游引物 R22μL，dNTP1．6μL，Mg2＋2μL，10×Buffer2μL，Taq酶0．2μL，ddH2O 7．2μL。預變性3min，93℃變性反應20s，53℃退火延伸15s，進行40個循環(huán)，于53℃檢測熒光信號。

1．2．4 實時定量PCR實驗條件的優(yōu)化

1．2．4．1 敏感性 將質(zhì)粒按l0倍比例稀釋至濃度極限101copies／μL，雙蒸水為陰性對照，進行熒光定量PCR反應，以可區(qū)別陰性對照的最低質(zhì)粒濃度為最低檢測值。

1．2．4．2 特異性 用福氏志賀菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、腸球菌制備模板，用建立的方法進行檢測。1．2．4．3 穩(wěn)定性 將不含Taq酶及模板外的全部PCR試劑混合為反應液，分別取107～101copies／μL梯度的質(zhì)粒，制作標準曲線，將剩余的反應液及標準品質(zhì)粒置于－20℃凍存，每兩天凍融一次，1月后后使用相同試劑再次制作標準曲線，對比兩條標準曲線。

1．2．4．4 重復性 批內(nèi)重復性：一次檢測對一個濃度臨床樣品重復做10個平行管，以Ct值計算SD和CV。批間重復性：1天之內(nèi)對一個濃度臨床樣品重復檢測10次，以Ct值計算SD和CV。天間重復性：檢測一個濃度臨床樣品，每天測一次，連續(xù)測定10d，記錄結果并以Ct值計算SD和CV。

1．2．4．5 臨床糞便標本的檢測 將收集臨床可疑糞便樣本15份，取約黃豆大小的可疑糞便于0．5 mL PBS 0．1mmol／L pH 值為7．4，漩渦混勻，取上層至另一離心管中，10 000r／min離心5min，棄上清液，洗滌1次，加入100μL裂解液，漩渦混勻，100℃煮沸10min，10 000r／min離心5min。取上清液進行熒光定量PCR擴增反應，分離培養(yǎng)組作為對照。1．2．4．6 與TaqMan方法比較 應用商品化的志賀菌TaqMan檢測試劑盒（上?？婆d生物科技有限公司）與建立的二聚體蝎型探針法同時檢測25份可疑糞便標本，檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2．1 志賀菌標準品重組質(zhì)粒的構建 使用志賀菌基因組DNA進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到約151bp片段，結果見圖1。產(chǎn)物純化回收，將目的基因克隆至載體，提取構建質(zhì)粒進行酶切、測序等工作，證實擴增片段與目的序列相符。

圖1 PCR擴增ipaH基因電泳結果Marker：DNA 標 準 品 （DL－2000）；1：PCR 產(chǎn) 物 （151 bp）Fig．1 PCR amplification of ipaH productsMarker：DNA marker－DL2000；1：PCR products of ipaH （151bp）

2．2 標準曲線的繪制 將制備的志賀菌重組質(zhì)粒標準品稀釋，采用上述的熒光定量PCR擴增體系進行反應，重組質(zhì)粒標準品的濃度調(diào)整與108～101copies／μL時，可出現(xiàn)理想的擴增曲線（圖2）和標準曲線（圖3）。

2．3 特異性 利用所建立的方法進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)僅有福氏志賀菌為陽性，其余的均為陰性，證明該方法的特異性好。

2．4 敏感性 將標準品原液作梯度稀釋，分別為108～101copies／μL，進行熒光定量 PCR 反應（圖4），本法最低可檢測濃度為10copies／μL。

2．5 穩(wěn)定性 試劑經(jīng)反復凍融后，制作標準曲線分別為：Y＝－3．472 9X＋39．121，相關系數(shù)為0．9972；與凍融前的標準曲線比較：Y＝－3．5279X＋39．851，相關系數(shù)為0．996 7；證實試劑的穩(wěn)定性較好，反復凍融對檢測結果的影響小，結果分別見圖5、圖6。

圖2 志賀菌重組質(zhì)粒標準品熒光定量PCR擴增曲線從左至右分別為108～101copies／μL 8個不同濃度標準品的熒光曲線Fig．2 Amplification curves of the recombinant plasmid From the left to the right：108－101copies／μL of the recombinant plasmid fold dilution respectively．

圖3 志賀菌重組質(zhì)粒標準品熒光定量PCR標準曲線Fig．3 Standard curve of the recombinant plasmid

圖4 熒光定量PCR的敏感性試驗與x軸接近平行的熒光曲線為陰性對照Fig．4 Results of sensitivity test of RT－PCR Fluorescence curve parallel to X axis is the negative control．

圖5 試劑反復凍融前標準曲線Fig．5 Standard curve before repeated freezing and thawing of reagent

圖6 試劑反復凍融后標準曲線Fig．6 Standard curve after repeated freezing and thawing of reagent

2．6 重復性 結果表明樣品的批內(nèi)重復性、批間重復性和天間重復性CV分別為1．61%、1．93%、2．10%，具有良好的重復性。

2．7 臨床糞便標本的檢測結果 應用實時熒光定量PCR方法和分離培養(yǎng)法分別對15份可疑的糞便標本進行檢測，并對比分析，結果顯示熒光定量PCR法檢測9例為陽性，陽性檢出率為：60% ；分離培養(yǎng)法檢測7例為陽性，陽性檢出率：46．7%?？梢姛晒舛縋CR法于分離培養(yǎng)法均能有效的檢測出糞便標本中少量的志賀菌，但熒光定量PCR法僅需要4h，而分離培養(yǎng)法需要3～4d，時間差異明顯。

2．8 與TaqMan方法比較結果 應用本方法和志賀菌TaqMan檢測試劑盒分別對25份可疑糞便標本進行檢測，本法陽性14例，陽性檢出率為：56%；TaqMan定量試劑盒檢測9例陽性，陽性檢出率為36%。Fisher精確概率計算兩法檢出率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），二聚體蝎型探針法的敏感性高于TaqMan方法。9例標本兩法檢測均為陽性，其結果呈偏態(tài)分布，經(jīng)符號秩檢驗差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。

3 討 論

志賀菌屬于無動力、無芽孢的G－桿菌，是引起細菌性痢疾發(fā)病及傳播的主要致病菌，通過受到污染的水源、食物，經(jīng)過糞口途徑傳播，可引起大范圍的爆發(fā)及流行，嚴重危害公共安全，因此一直受到重點監(jiān)測，一旦出現(xiàn)可疑病例，往往動用多方資源，早期的隔離治療［5］。在我國，菌痢被列為法定傳染病，須及時上報，危害性僅次于結核和肝炎，在感染性腹瀉的發(fā)病比例中居首位。志賀菌屬可分為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌四個群屬，分別簡標為 A、B、C、D［6－7］。近年來通過分子生物學的相關手段檢測志賀菌的臨床應用已普遍開展，且有逐漸取代常規(guī)的生物培養(yǎng)鑒定、抗原與抗體檢測的趨勢，準確性較高，對于疾病的早期診斷、治療、患者隔離有重要的意義。因此通過分子生物學方法建立敏感、特異的志賀菌檢測方法是當務之急［8］。

所有產(chǎn)毒的志賀菌中都有侵襲性大質(zhì)粒，大小約220kb。侵襲性質(zhì)?？乖颍╥paH）同時存在于染色體和侵襲性大質(zhì)粒上，而且是多拷貝分散存在（4～10個），因而從ipaH設計引物建立PCR方法應該有較高的敏感性，并可避免因基因突變、質(zhì)粒丟失而導致的假陰性。因此ipaH通常作為志賀菌屬的鑒定基因［9－10］。

熒光定量PCR廣泛的應用于基礎醫(yī)學研究及臨床應用中，但由于現(xiàn)有的Taqman探針存在較難純化、標記的缺陷，且該檢測對Taqman自身的要求高，反應時間長，較難滿足要求［11－12］。因此通過二聚體蝎形熒光探針技術進行定量檢測，有更好的可操作性及準確性。應用蝎形熒光探針進行檢測無特異性產(chǎn)物時，淬滅鏈與報告鏈雜交，檢測不到熒光；當有特異產(chǎn)物時，分子內(nèi)部的雜交比分子間容易，因此報告鏈更易與產(chǎn)物連雜交，可檢測到熒光［13］。因為整個雜交反應過程是單個分子內(nèi)部的作用，背景的干擾低，熒光信號易于檢測，且檢測靈敏度高，便于臨床的開展及應用［14］。

可疑糞便標本檢測結果顯示，本方法靈敏度明顯高于利用Taqman技術建立的方法，這是由于此種探針的熒光強度高于TaqMan探針。這種探針具有快循環(huán)的特點，我們自行設計探針擴增出的片段長82bp，擴增條件：93℃3min、93℃20s、53℃15 s，并采集熒光信號，經(jīng)40個循環(huán)左右約70min即可得到結果，所需時間較Taqman探針（2h左右）明顯縮短。這種探針設計簡單，不需要專門軟件，合成成本較低，所需的條件和技術水平較低，即使一般的實驗室也比較容易開展。

與傳統(tǒng)的志賀菌定量檢測不同，本研究根據(jù)志賀菌中特異的ipaH基因為目的片段，成功的構建質(zhì)粒，轉染入志賀菌屬，制備了可供大量使用的標準品。后應用二聚體蝎形熒光探針技術，通過熒光定量PCR法檢測志賀菌，以期為志賀菌的快速檢測奠定實驗基礎。通過建立二聚體蝎形探針熒光定量PCR法，檢測志賀菌，結果證實該檢測法快速靈敏，特異性高，穩(wěn)定性好，實驗結果達到了預期效果，可滿足對于志賀菌的早期篩查、確診需要，今后可在傳染病監(jiān)測等工作方面開展應用。

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