胡 群，馬思杰，童淑梅

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）漢坦病毒屬（geneus hantavirus）［1］。根據(jù)漢坦病毒基因分子結(jié)構(gòu)和抗原性的不同，將漢坦病毒至少分為34個血清型／基因型［2－3］，包括漢灘型病毒（Hantaan Virus，HTNV），漢城型病毒（Seoul Virus，SEOV），普馬拉型病毒（Puumala Virus，PUUV），多 不 拉 伐 型 病 毒 （Dobrava Virus，DOBV），圖拉型病毒（Tula virus，TULV），索托帕拉雅型病毒（Thottapalayam virus，THOV）和安第斯型病毒（Andes virus，ANDV）等。對于漢坦病毒的基因分型目前主要采用的方法為通過設(shè)計各種基因型別病毒的特異性引物進行PCR擴增檢測［4－5］，但是這種方法，只能針對性的檢測已知的某種或者幾種病毒，對于存在的未知基因型別病毒，可能會漏檢。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，依據(jù)同一個病毒家族中共有的保守基因序列所設(shè)計的簡并引物，可以實現(xiàn)對不同基因型別病毒的同時擴增檢測。CODEHOP是一種最新的簡并引物設(shè)計方法，解決了傳統(tǒng)方法設(shè)計的簡并引物靈敏度不高和特異性差的缺點，已被逐步得到應(yīng)用［6－7］。本文探討了針對漢坦病毒屬病毒設(shè)計的一對CODEHOP簡并引物，結(jié)合RTPCR技術(shù)所建立的漢坦病毒屬CODEHOP RTPCR檢測方法對漢坦病毒基因型別鑒定和分子溯源的應(yīng)用效果。

1 材料和方法

1．1 病毒樣品 漢灘型漢坦病毒（HTNV）陽性鼠肺樣品DX0901，由本實驗室在2009年大榭港區(qū)媒介監(jiān)測捕獲的社鼠中分離。漢城型漢坦病毒（SEOV）陽性鼠肺樣品DX1101，由本實驗室在2011年從入境集裝箱中捕獲的褐家鼠中分離。

1．2 試劑 Ribounclease inhibition、100bp ladder marker、瓊脂糖均購自寶生物工作（大連）有限公司，病毒RNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物膠中回收試劑盒、一步法RT－PCR試劑盒購自德國Qiagen公司。

1．3 方法

1．3．1 病毒RNA提取 取約50mg鼠肺樣品，研磨勻漿后參照Qiagen公司RNA提取試劑盒使用說明書提取病毒RNA，用40μL無RNA酶的超純水溶解，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 引物合成 從GenBank中下載不同基因型別漢坦病毒病毒L基因組片段蛋白質(zhì)氨基酸序列，用CODEHOP引物專業(yè)設(shè)計軟件設(shè)計引物，引物序列如下：上游引物 G1：5′GCA ACA GCA ACA TGG TTT car tay tay ac－3′；下游引物 G2：5′CTT CTT CAT TCAT ATT TCC ATG Car ncc ytt ytc－3′。引物由上海英駿生物工程公司合成。

1．3．3 CODEHOP RT－PCR反應(yīng)體系 采用一步法RT－PCR試劑盒進行病毒模板目標(biāo)基因片段擴增，反應(yīng)體系（50μL）：其中 RNase Free Water 19 μL ，5×RT－PCR Buffer 10μL，10mmol／L dNTP Mixture 2μL，Enzyme Mix 2μL，Ribonuclease Inhibitor 1μL，20μmol／L上游引物G1 4μL，下游引物G2 2μL，RNA模板10μL。反應(yīng)程序為60℃1min，42℃10min，50℃30min，95℃15min反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，94℃30s，52℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃7min，4℃保存。

1．3．3 擴增產(chǎn)物序列分析 取5μL PCR擴增產(chǎn)物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。剩余擴增產(chǎn)物送上海英俊生物工程公司進行測序，測序后得到的片段序列登錄NCBI進行同源性比對，判定基因型別。選擇在GenBank上已經(jīng)公開發(fā)表的11種基因型別的35個漢坦病毒株，見表1，利用Mega5．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并計算遺傳距離。

表1 研究中使用的漢坦病毒毒株及來源Tab．1 Hantavirus strains and their origination in research

2 結(jié) 果

2．1 PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果 漢灘病毒（HTNV）DX0901和漢城病毒（SEOV）DX1101，經(jīng) CODEHOP RT－PCR擴增后得到的電泳結(jié)果顯示（圖1），均獲得預(yù)期大小的目的片段擴增產(chǎn)物（478bp）。

圖1 漢坦病毒PCR產(chǎn)物電泳圖1：漢灘病毒DX0901擴增產(chǎn)物；2漢城病毒DX1101擴增產(chǎn)物；3：陰性對照 M：100bp ladder markerFig．1 Electrophoresis of hantavirus PCR products1：PCR product of hantaan virus DX0901；2：PCR product of Seoul virus DX1101；3：Negative control；4：100bp DNA ladder marker

2．2 PCR產(chǎn)物序列分析結(jié)果 DX0901，DX1101病毒擴增產(chǎn)物測序后，用軟件Mega 5．0進行分析，去除引物部分序列，均獲得大小415bp的序列片段（表2），通過Blast檢索GenBank進行同源性比對。結(jié)果顯示，病毒株DX0901與漢灘型病毒Nc167同源性最為接近，達87%。病毒株DX1101與漢城型病毒ZT10，ZT71，Z37同源性最為接近，均為95%。

2．3 漢坦病毒基因進化分析 以不同漢坦病毒株L基因G1G2片段核苷酸序列為依據(jù)，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖2所示，漢坦病毒DX0901與漢灘型（HTN）病毒株Nc167位于同一分支，DX1101與5株漢城型病毒株處于同一分支。從軟件計算的遺傳距離來看（表3），DX0901與Nc167的遺傳距離最為接近值為0．142，DX1101與ZT10，L99，Z37的遺傳距離最為接近值為0．049。

3 討 論

CODEHOP方法所設(shè)計的引物稱之為一致簡并雜合寡核苷酸引物（consensus－degenerate hybrid oligonucleotide primer，CODEHOP），該引物由3′端簡并的核心區(qū)和5′端為非簡并夾板區(qū)2個部分組成，與常規(guī)方法設(shè)計的簡并引物相比具有簡并度低、退火溫度高、特異性更強等優(yōu)勢，目前已經(jīng)被應(yīng)用于克隆未知病毒或基因的檢測［8－11］。本研究團隊已經(jīng)將該CODEHOP應(yīng)用于漢坦病毒屬病毒簡并引物的設(shè)計，將所獲得的CODEHOP引物與RT－PCR相結(jié)合，建立了漢坦病毒屬CODEHOP RT－PCR檢測體系，可以實現(xiàn)對漢坦病毒屬內(nèi)已知病毒和未知病毒的檢測［12］。

表2 2個病毒PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Tab．2 Sequences of PCR products of 2viruses

本文證實了所建立的CODEHOP RT－PCR方法可以對大榭港區(qū)分離的兩個不同基因型別的漢坦病毒進行擴增，并獲得目的片段大小（478bp）的擴增產(chǎn)物。通過電泳進行觀察，可以用于判定樣品感染病毒情況。將擴增產(chǎn)物序列登錄NCBI進行Blast同源性比對，可以進行基因型別鑒定，CODEHOP RT－PCR方法所獲得的型別鑒定結(jié)果與已知的結(jié)果一致。用 Mega 5．0軟件建立系統(tǒng)進化樹，可以獲得兩種漢坦病毒與GenBank上公布的已知漢坦病毒株的親源關(guān)系方面的信息。

表3 漢坦病毒DX0901DX1101與不同基因型別漢坦病毒遺傳距離Tab．3 Genetic distance of the hantavirus DX0901and DX1101with different hantavirus strain

本文從GenBank里選擇漢坦病毒屬的11種基因型別的35個漢坦病毒株進行了相應(yīng)L基因核序列的分析，發(fā)現(xiàn)都存在G1，G2引物的結(jié)合位點，因此理論上這些型別的漢坦病毒均可以通過本文建立的CODEHOP RT－PCR體系進行擴增，進而實現(xiàn)對不同漢坦病毒的基因型別鑒定和分子溯源。

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