馮倩，穆麗，鄭偉，蘇瑞強(qiáng),2，惠建國,2，趙志全,2

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.臨沂市紅十字會(huì) 中心血站，山東 臨沂 276000)

不同產(chǎn)地蒲公英藥材中總黃酮和咖啡酸含量分析與評價(jià)△

馮倩1,2*，穆麗3，鄭偉1，蘇瑞強(qiáng)1,2，惠建國1,2，趙志全1,2

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006；
2.中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.臨沂市紅十字會(huì) 中心血站，山東 臨沂 276000)

目的：建立不同產(chǎn)地蒲公英藥材綜合質(zhì)量評價(jià)方法。方法:采用紫外-可見分光光度法測定蒲公英總黃酮含量，采用HPLC測定其咖啡酸的含量。結(jié)果:不同產(chǎn)地蒲公英總黃酮和咖啡酸的含量均差異較大，總黃酮含量在28.63～51.79 mg·g-1，咖啡酸含量在0.007 6%～0.042 4%。結(jié)論:以總黃酮和咖啡酸作為質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，建立的方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，結(jié)果表明山東臨沂蒲公英的質(zhì)量較好。

蒲公英；不同產(chǎn)地；總黃酮；咖啡酸

蒲公英為中醫(yī)臨床常用中藥，為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.Mazz、堿地蒲公英TaraxacumborealisinenseKitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味苦、甘，性寒。歸肝、胃經(jīng)。具有清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋的功能，用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰疬，目赤，咽痛，肺癰，腸癰，濕熱黃疸，熱淋澀痛[1]。我國藥用蒲公英資源豐富但種類繁多，分布廣泛[2]，質(zhì)量參差不齊。據(jù)報(bào)道，蒲公英的主要活性成分是黃酮類、有機(jī)酸和甾醇類物質(zhì)[3]。因此，實(shí)驗(yàn)以總黃酮和咖啡酸為指標(biāo)，分別采用紫外-可見分光光度法和HPLC測定了14個(gè)產(chǎn)地蒲公英的總黃酮和咖啡酸含量，為評價(jià)蒲公英藥材的質(zhì)量提供依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀；G1314A型紫外檢測器；Agilent1100工作站；島津UV-2401PC型紫外可見分光光度計(jì)；梅特勒AG285型電子分析天平；FA1004型電子分析天平；LD-400A型高速多功能搖擺粉碎機(jī)(浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；KDM型控溫電熱套(鄄城華魯電熱器有限公司)。

蒲公英藥材系作者到各地自行采購，產(chǎn)于安徽、河南、山西、山東、河北、甘肅、陜西、黑龍江等地(均為秋季采收)，經(jīng)魯南制藥集團(tuán)股份有限公司惠建國博士鑒定為堿地蒲公英TaraxacumborealisinenseKitag；咖啡酸、蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110885-200102，0080-9705)；純化水、蒸餾水自制；甲醇為色譜級，其余所用試劑為AR級。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液配制[4]精密稱取120 ℃減壓干燥恒重的蘆丁對照品19.749 mg,置100 mL量瓶中，精密加乙醇70 mL使之溶解，加蒸餾水至刻度，搖勻即得(含蘆丁0.197 49 mg·mL-1)。

2.1.2 蘆丁吸收曲線 精密量取蘆丁對照品溶液、供試品溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，依次加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加10%氫氧化鈉溶液4 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻。隨行做空白對照，于200～800 nm波長范圍內(nèi)全波掃描，最大吸收波長為510 nm，因此選定510 nm作為檢測波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁對照品溶液0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0 mL，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，隨行做空白對照，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)(X)，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=12.6X+0.016 7，r=0.999 6，線性范圍0.005～0.059 mg·mL-1。

2.1.4 供試品溶液制備

2.1.4.1 提取溶劑的選擇 精密稱取安徽碭山樣品7份，每份0.5 g，分別加50 mL水、甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和無水乙醇，稱定重量，水浴回流提取1 h，放冷，稱重，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，過濾，各吸取0.5 mL，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，分別為42.10，24.61，35.42，36.84，40.43，35.22，18.64 mg·mL-1，結(jié)果表明以水和70%乙醇為提取溶劑效果最好，但用水提取時(shí)藥材粉末漂浮在水面且極易粘附在瓶壁上，影響提取率，而用70%乙醇提取時(shí)藥材粉末沉在溶劑底部，避免了這種問題，故選擇70%乙醇作為提取溶劑。

2.1.4.2提取方法的選擇 精密稱取安徽碭山樣品2份，每份0.5 g，加50 mL 70%乙醇，分別采用回流和超聲方式提取1 h，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量分別為38.01，28.13 mg·mL-1，結(jié)果表明回流法提取率較高。

2.1.4.3 溶劑用量的選擇 精密稱取河南鹿邑樣品3份，每份0.5 g，分別加25，50，100 mL 70%乙醇，回流提取1 h，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量分別為34.88，36.84，39.19 mg·mL-1。結(jié)果表明用100 mL(200倍)溶劑提取率較高。

2.1.4.4 提取時(shí)間的選擇 精密稱取山東臨沂樣品0.5 g，加100 mL 70%乙醇，回流提取，于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h取樣1 mL，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量分別為39.63，41.29，41.57，41.84，41.29 mg·mL-1。結(jié)果表明，提取時(shí)間超過1 h時(shí)，總黃酮含量基本無變化，故選擇提取時(shí)間為1 h。

通過上述試驗(yàn)，確定供試品溶液的制備方法為用200倍藥材量的70%乙醇回流提取1 h。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取山東臨沂樣品5份，按2.1.4項(xiàng)制備供試液，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果RSD=0.57%，表明重復(fù)性良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取山西太原樣品0.25 g，按2.1.4項(xiàng)制備供試液，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處在0，10，20，30，40，50 min時(shí)測定吸光度，結(jié)果RSD=0.44%，表明供試品溶液在50 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的河北安國樣品0.1 g，5份，分別加入蘆丁對照品(0.197 49 mg·mL-1)15 mL，按2.1.4項(xiàng)制備供試液，按2.1.2項(xiàng)于510 nm波長處測定吸光度，測定含量并計(jì)算，結(jié)果總黃酮的平均回收率為104.6%，RSD=1.8%，結(jié)果見表1。

表1 總黃酮加樣回收率測定

注：蘆丁對照品加入量均為2.962 4 mg

2.1.8 樣品總黃酮含量的測定 精密量取蘆丁對照品溶液、不同產(chǎn)地供試品溶液1.0 mL，測定吸光度，計(jì)算蒲公英中總黃酮含量。結(jié)果見表2。

表2 蒲公英中總黃酮含量測定

2.2 咖啡酸含量的測定[1]

2.2.1色譜條件 色譜柱：Diamomil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm，迪瑪公司)；流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉1.56 g，加水使溶解成1 000 mL，再加1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.8～4.0，即得)(23∶77)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：323 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸對照品9.72 mg，置 50 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得 0.194 44 mg·mL-1對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粗粉約1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加5%甲酸的甲醇溶液10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用5%甲酸的甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，置棕色量瓶中，即得。

2.2.3 咖啡酸含量測定 不同產(chǎn)地的蒲公英藥材按供試品溶液制備項(xiàng)下處理后，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，用外標(biāo)法計(jì)算蒲公英中咖啡酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 蒲公英中咖啡酸含量測定 /%

3 討論

蒲公英藥效成分復(fù)雜，2010年版《中國藥典》只收錄了咖啡酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)[1]。據(jù)報(bào)道，總黃酮具有顯著的抑菌、抗病毒作用[5]，是蒲公英重要的藥效成分，因此，作者建立了蒲公英中總黃酮的測定方法，經(jīng)驗(yàn)證此法簡單便捷，可行性好；同時(shí)對不同產(chǎn)地蒲公英的總黃酮和咖啡酸含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示不同省份的藥材含量有明顯差異，安徽、山東、陜西蒲公英黃酮含量較高，安徽、山東、山西、黑龍江等地蒲公英咖啡酸含量較高；相同省份不同地區(qū)的藥材，含量差異也較大；安徽亳州人工種植黃酮含量高于野生采收，但咖啡酸含量較低；山東臨沂蒲公英黃酮含量和咖啡酸含量均較高。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：331.

[2] 孟志云，徐綏緒，沈建平.蒲公英的研究進(jìn)展[J].人民軍醫(yī)藥學(xué)?？?997,13(2):83-87.

[3] 路保通，張鴦，胡新安，等.蒲公英有效成分提取及其抑菌活性作用[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44(5)：45-46.

[4] 李喜鳳，杜云鋒，郝哲.蒲公英中總黃酮的含量測定[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(6):1219-1220.

[5] 王曉梅,曹穩(wěn)根.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].宿州學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(1):105-107.

DeterminationofTotalFlavonoidandCaffeicAcidinTaraxacumofficinalefromDifferentHabitats

FENG Qian1，2*，MU Li3，ZHENG Wei1，SU Rui-qiang1，2，HUI Jian-guo1，2，ZHAO Zhi-quan1，2

(1.LunanPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Linyi276005，China；2.StateKeyLaboratoryofGenericManufactureTechnologyofChineseTraditionalMedicine，Linyi276006,China；3.LinyiRedCrossBloodCenter，Linyi276000,China)

Objective：To establish a comprehensive quality evaluation method forTaraxacumofficinalefrom different habitats.Methods：Using ultraviolet-visible spetrophotometry determine total flavonoid and using HPLC determine caffeic acid content.Results：The total flavonoid content is 28.63-51.79 mg·g-1and the caffeic acid content is 0.007 6%-0.042 4%，which are remarkably different in different habitats.Conclusion：Shandong linyi medicinal materials quality is better according to total flavonoid and caffeic acid content.The method is convenient，rapid and accurate，which will be helpful for quality assessment ofTaraxacumofficinale.

Taraxacum；Different habitats；Total flavonoid；Caffeic acid

2013-03-23)

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山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011YD19015)

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馮倩，工程師，主要研究方向：中藥新藥研究與開發(fā)，Tel:(0539)8336639，E-mail：fengqian1981p@126.com