楊穎，王宏偉，于文靜

(吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033)

HPLC測(cè)定心悅膠囊中人參皂苷Rg1、Re及Rb3的含量

楊穎*，王宏偉，于文靜

(吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的：研究心悅膠囊中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb3的定量方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱：Lun C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。結(jié)果：線性范圍為人參皂苷Rg1在0.098 9～1.978 0μg(r=0.999 1，n=5)，人參皂苷Re在0.312 0～5.38 μg(r=0.999 2，n=5)，人參皂苷Rb3在0.448～8.96 μg(r=0.999 1，n=5)。平均加樣回收率人參皂苷Rg1為97.1%，RSD=2.46%(n=6)，人參皂苷Re為97.5%，RSD=1.89%(n=6)，人參皂苷Rb3為100.0%，RSD=2.28%(n=6)。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于心悅膠囊的質(zhì)量控制。

人參皂苷Re；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb3；心悅膠囊；高效液相色譜

心悅膠囊是由西洋參莖葉總皂苷制成的單方制劑，具有益氣養(yǎng)心，和血之功效。用于冠心病心絞痛屬于氣陰兩虛證者。原標(biāo)準(zhǔn)僅建立了以人參皂苷Rb3為對(duì)照，采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，不能全面有效地控制該品種的內(nèi)在質(zhì)量，故被列為國(guó)家中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃品種。西洋參PanaxquinquefoliumL.是五加科人參屬植物，為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材之一。西洋參莖葉屬于其地上部位，現(xiàn)代研究證明，西洋參地上部位含有以人參皂苷為主的多種活性成分[1-2]，西洋參莖葉總皂苷即為西洋參莖葉提取物。作者在參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]的基礎(chǔ)上，建立了以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb3為對(duì)照品，采用高效液相色譜法測(cè)定本制劑中西洋參莖葉總皂苷的含量，旨在全面、有效控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀。人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：110703-201027)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào)：110754-200822)、人參皂苷Rb3對(duì)照品(批號(hào)：111686-200501)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。心悅膠囊(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.3 g/粒，批號(hào)：100624，100717，100718，100819，100820，090510)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lun C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)樣量5 μL，理論板數(shù)按人參皂苷Re計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品及人參皂苷Rb3對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1對(duì)照品0.1 mg、人參皂苷Re對(duì)照品及人參皂苷Rb3對(duì)照品各0.4 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。HPLC圖見(jiàn)圖1。

A.人參皂苷Rg1對(duì)照品 B.人參皂苷Re對(duì)照品 C.人參皂苷Rb3對(duì)照品 D.供試品 E.陰性對(duì)照品圖1 心悅膠囊及對(duì)照品HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：110703-201027)濃度為0.102 7 mg·mL-1、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào)：110754-200822)濃度為0.351 3 mg·mL-1、人參皂苷Rb3對(duì)照品(批號(hào)：111686-200501)濃度為0.448 mg·mL-1的溶液，分別注入液相色譜儀，按擬定色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。人參皂苷Rg1回歸方程為：Y=319.51X+14.726，r=0.999 1，結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在0.098 9～1.978 0 μg線性關(guān)系良好；人參皂苷Re回歸方程為Y=308.56X+27.87，r=0.999 2，結(jié)果表明，人參皂苷Re在0.312 0～5.38 μg線性關(guān)系良好；人參皂苷Rb3回歸方程為Y=249.41X+34.559，r=0.999 1，結(jié)果表明，人參皂苷Rb3在0.448～8.96 μg線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)6次，測(cè)定其色譜峰面積，人參皂苷Rg1平均值為250.00，RSD=2.51%；人參皂苷Re平均值為788.99，RSD=0.95%；人參皂苷Rb3平均值為1 101.81，RSD=1.16%。結(jié)果表明所用儀器具良好的精密性。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取本品(批號(hào)：100624)，傾出內(nèi)容物，混勻，按供試品溶液制備方法制備，獨(dú)立配制6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，人參皂苷Rg1的RSD=1.01%；人參皂苷Re的RSD=0.53%；人參皂苷Rb3的RSD=0.78%。結(jié)果表明本法重現(xiàn)性較好，精密度較高。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取同法測(cè)定已知含量的供試品(批號(hào)：100624)6份，每份0.75 g，分別精密量取人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201027)濃度為0.844 mg·mL-1的對(duì)照品溶液5 mL，加入樣品中，按擬訂標(biāo)準(zhǔn)的方法提取、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人參皂苷Rg1回收率試驗(yàn)

注：人參皂苷Rg1對(duì)照品加入量均為4.22 mg

精密量取同法測(cè)定已知含量的供試品(批號(hào)：100624)6份，每份0.75 g，分別精密量取人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào)：110754-200822)濃度為1.242 mg·mL-1的對(duì)照品溶液10 mL，加入樣品中，按擬訂標(biāo)準(zhǔn)的方法提取、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

精密量取同法測(cè)定已知含量的供試品(批號(hào)：100624)6份，每份0.75 g，分別精密量取、人參皂苷Rb3對(duì)照品(批號(hào)：111686-200501)濃度為21.78 mg·mL-1的對(duì)照品溶液10 mL，加入樣品中，按擬訂標(biāo)準(zhǔn)的方法提取、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 人參皂苷Re回收率試驗(yàn)

注：人參皂苷Re對(duì)照品加入量均為12.42 mg

表4 人參皂苷Rb3回收率試驗(yàn)

注：人參皂苷Rb3對(duì)照品加入量均為21.78 mg

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)同一份供試品溶液(批號(hào)：100624)，按正文色譜條件，每隔8 h進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1的RSD=1.54%，人參皂苷Re的RSD=1.50%，人參皂苷Rb3的RSD=0.56%，結(jié)果表明48 h內(nèi)供試品溶液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb3含量基本穩(wěn)定。

2.10 空白試驗(yàn)

為進(jìn)一步考察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性，取不含西洋參莖葉總皂苷的陰性對(duì)照樣品適量，按正文含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果陰性樣品色譜中在與人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb3峰相應(yīng)的保留時(shí)間位置處無(wú)干擾峰檢出(見(jiàn)圖1)，從而證明本法是合理可行的。

2.11 樣品含量測(cè)定

照上述方法測(cè)定6批樣品，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 6批心悅膠囊樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb3含量測(cè)定 mg/粒

根據(jù)6批樣品含量測(cè)定結(jié)果，并考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的波動(dòng)，含量限度暫定本品每粒含西洋參莖葉總皂苷以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb3總量計(jì)，不得少于5.5 mg。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取人參皂苷Rg1、Re、Rb3的甲醇溶液，經(jīng)UV-2550紫外分光光度計(jì)，在190～400 nm掃描，參考《中國(guó)藥典》2010年版一部西洋參及人參含量測(cè)定項(xiàng)下波長(zhǎng)，故選擇203 nm為實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 色譜柱的選擇

曾分別采用Agilent HC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil(2) C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3個(gè)不同的C18色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示均可得到良好的分離。故規(guī)定本法的理論板數(shù)按人參皂苷Re峰計(jì)不得低于6 000。

3.3 提取方法與提取時(shí)間考察

分別對(duì)4種提取方法進(jìn)行了考察。

(1)按原標(biāo)準(zhǔn)方法提取，取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，加甲醇50 mL使溶解，濾過(guò)，殘?jiān)蛹状枷礈?次，每次20 mL，合并濾液及洗滌液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，并定量轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(2)取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(3)取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量超聲處理30 min，放冷；加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(4)取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇適量超聲處理30 min，放冷；加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

結(jié)果(1)、(2)、(4)相差不大，(3)因溶解時(shí)極易產(chǎn)生泡沫，溶解效果不佳，不易定容，無(wú)法進(jìn)行測(cè)定?？紤]到實(shí)驗(yàn)方便和節(jié)省時(shí)間，故選擇方法(2)。

實(shí)驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好，為心悅膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了參考依據(jù)。

[1] Wang W, Zhao Y Q, Rayburn ER,et al.In vitro anti-cancer activity and structure-activity relationships of natural products isolated from fruits ofPanaxginseng[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2007，59(5)：589-601.

[2] 翟鵬貴，趙珺彥，祝鈴棟，等.西洋參制劑抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，(6)：761-762 .

[3] 黃新生.高效液相色譜法測(cè)定人參莖葉浸膏及人參根中的人參皂苷含量[J].中國(guó)中藥雜志，2001，26(3)：29-31.

[4] 許傳蓮.RP-HPLC法測(cè)定西洋參莖葉中6種人參皂苷的含量[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，(3)：53-55.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：8.

[6] 李儼，李敬華.人參消渴膠囊中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥業(yè)，2011，20(2)：48-49.

TheDeterminationofGinsenosideRg1，GinsenosideReandGinsenosideRb3inXinyueCapsulesByHPLC

YANG Ying*，WANG Hong-wei，YU Wen-jing

(JilinInstituteforFoodandDrugControl，Changchun130033，China)

Objective：An assay method was developed for the determination of Ginsenoside Rg1、Ginsenoside Re and Ginsenoside Rb3in Xinyue Capsules by HPLC.Methods：The analysis was performed on Lun C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.Acetonitrile-water gradient elution，detector wavelength 203 nm；Results：Ginsenoside Rg1linear range is 0.098 9-1.798 0 μg；relevant coefficientr=0.999 1(n=5)，Ginsenoside Re linear range is 0.312 0-5.38 μg；relevant coefficientr=0.999 2(n=5)，Ginsenoside Rg1avevage recovery is 97.1%，RSD=2.46%(n=6).Ginsenoside Re avevage recovery is 97.5%，RSD=1.89%(n=6)，Ginsenoside Rb3linear range is 0.448-8.96 μg；relevant coefficientr=0.999 1(n=5)，Ginsenoside Rb3avevage recovery is 100.0%，RSD=2.28%(n=6).Conclusion：The method is simple，rapid and accurate，it is suitable for the quality control of strychnine.

Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Re；Ginsenoside Rb3；Xinyue Capsules；HPLC

2013-01-18)

*

楊穎，E-mail：kangroo@xinhuanet.com