鄭偉然，陶永華，施靜，胡楊，邵杰，蕭偉*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

中藥工業(yè)

當(dāng)歸揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝的優(yōu)化△

鄭偉然1，2，陶永華1，2，施靜1，2，胡楊1，2，邵杰1，2，蕭偉1，2*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

目的：當(dāng)歸揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)化研究。方法：以得油率為指標(biāo)，以液料比、蒸餾時(shí)間、氯化鈉用量為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果：得出最佳提取工藝為液料比6∶1，蒸餾時(shí)間8 h，氯化鈉用量為當(dāng)歸的1/5，得油率可達(dá)0.4%。結(jié)論：工藝合理，方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠。

當(dāng)歸；揮發(fā)油；藁苯內(nèi)酯；提取工藝

當(dāng)歸為臨床常用中藥，具有補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)腸通便的功能[1]。當(dāng)歸的化學(xué)成分含藁本內(nèi)酯、阿魏酸等[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藁本內(nèi)酯具有抑制子宮平滑肌的收縮、松弛氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜、降血壓、降體溫、抑制膠原誘發(fā)和血小板聚集活性等藥理作用。

當(dāng)歸揮發(fā)油的提取方法雖然很多，但最常用的仍然是水蒸氣蒸餾法，有機(jī)溶劑提取法有有機(jī)溶劑殘留，超臨界萃取法工藝、設(shè)備要求較高，操作復(fù)雜。水蒸氣蒸餾法設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。為了更充分、完全提取揮發(fā)油，且要保證產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中提取工藝的簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單，經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)，中藥在提取揮發(fā)油時(shí)加入氯化鈉，可提高中藥揮發(fā)油的收率，如太子參、防風(fēng)、枳殼等。故本研究采用水蒸氣蒸餾法，對(duì)影響揮發(fā)油提取的諸多因素進(jìn)行了系統(tǒng)考察，在提取時(shí)加入氯化鈉，降低揮發(fā)油在水溶液中的溶解度，以提高揮發(fā)油提取率，并以藁本內(nèi)酯含量(HPLC)及揮發(fā)油得率為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，獲得最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 515泵，Waters 2487紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，Rheodyne進(jìn)樣器，中科院大連化學(xué)物理所WDL-95色譜工作站，揮發(fā)油提取器，電熱套，電子天平(萬(wàn)分之一)。

1.2 試藥

藁本內(nèi)酯對(duì)照品(南京中醫(yī)藥大學(xué)，純度：97.6%)，甲醇為色譜純(淮陰精細(xì)化工研究所)，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

當(dāng)歸購(gòu)自連云港市康濟(jì)大藥房，經(jīng)康緣藥業(yè)檢測(cè)中心鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels.的干燥根。經(jīng)檢驗(yàn)，符合《中國(guó)藥典》2010版一部當(dāng)歸藥材項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。取當(dāng)歸剪碎(長(zhǎng)度約為0.5～1 cm)，每次稱取當(dāng)歸360 g，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的量加入溶解好的氯化鈉水溶液，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，并在收集管內(nèi)加入乙酸乙酯，蒸餾出的揮發(fā)油溶入乙酸乙酯中，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯，得當(dāng)歸揮發(fā)油。

2 方法

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)參考有關(guān)資料和預(yù)試驗(yàn)，認(rèn)為提取當(dāng)歸揮發(fā)油的主要影響因素為液料比、蒸餾時(shí)間、加入氯化鈉的量3個(gè)因素，用L9(34)正交表試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 藁本內(nèi)酯檢測(cè)方法

2.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(67∶33)(v/v)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm，理論板數(shù)按藁本內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 樣品制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品2.5 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。HPLC圖見(jiàn)圖1。

2.2.2.2 供試品溶液制備 取當(dāng)歸揮發(fā)油5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL超聲30 s使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密吸取樣品溶液5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。HPLC圖見(jiàn)圖2。

圖1 藁本內(nèi)酯對(duì)照品HPLC圖

圖2 當(dāng)歸揮發(fā)油供試品HPLC圖

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 000 μg·mL-1)，分別配成200，100，50，25，12.5，6.3 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。分別取上述對(duì)照品溶液5 μL，按照2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度(μg· mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=2.631×104X+9 747.481；r=1.000 0，說(shuō)明藁本內(nèi)酯在204.4～6.39 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)：001103)，按照2.2.1項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣7次，并計(jì)算色譜峰峰面積RSD=0.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品(批號(hào)：001103)的供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，10，12 h注入液相色譜儀，計(jì)算藁本內(nèi)酯峰面積的RSD=0.64%，結(jié)果表明供試液中藁本內(nèi)酯在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為001103的樣品，精密稱取0.1 g，共6份，按照2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，并按照2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，藁本內(nèi)酯色譜峰RSD=1.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一樣品(批號(hào)：001103)各5 mg，共6份，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲30 s使溶解，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液。精密吸取本品稀釋液各2.5 mL，置10 mL量瓶中，加入藁本內(nèi)酯對(duì)照液(0.419 mg·mL-1)0.40，0.50，0.60 mL各3份，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，并計(jì)加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 當(dāng)歸揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯加樣回收率試驗(yàn)

2.3 指標(biāo)

按《中國(guó)藥典》揮發(fā)油測(cè)定方法，計(jì)算當(dāng)歸揮發(fā)油得率[5]。

揮發(fā)油得率(mL·g-1)=提取物體積/當(dāng)歸原料質(zhì)量×100%

指標(biāo)=(揮發(fā)油得率×100)×(藁本內(nèi)酯含量×100)

3 結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 當(dāng)歸揮發(fā)油提取的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 當(dāng)歸揮發(fā)油提取的L9(34)正交試驗(yàn)方差分析表

注：F0.01(1，2)=99，F(xiàn)0.05(1，2)=19

通過(guò)表3直觀分析可知，各因素組合的極差大小分別為C>B>A，得出各因素對(duì)試驗(yàn)影響順序?yàn)镃>B>A。由表4方差分析結(jié)果可知，因素C(氯化鈉加入量)各水平間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其次是因素B(蒸餾時(shí)間)，而因素A(加水量)各水平間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在3個(gè)因素所確定的水平范圍內(nèi)，加入的氯化鈉量對(duì)揮發(fā)油提取得率及藁本內(nèi)酯含量影響很大。考慮在保證提取效果的基礎(chǔ)上盡可能降低成本，確定當(dāng)歸揮發(fā)油提取最佳工藝條件為A1B1C2，即液料比6∶1，蒸餾時(shí)間8 h，氯化鈉加入量為藥量的1/5。

4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取當(dāng)歸3份，每份1 kg，按確定的最佳工藝條件提取揮發(fā)油，并按照2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算藁本內(nèi)酯含量。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5。3次工藝驗(yàn)證的揮發(fā)油平均得率為0.4%，藁本內(nèi)酯平均含量為69%。

表5 當(dāng)歸揮發(fā)油提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

5 討論

當(dāng)歸揮發(fā)油一般采用水蒸氣蒸餾法提取，工藝簡(jiǎn)便可行、設(shè)備要求不高、成本低廉，但存在揮發(fā)油提取率不高的缺陷；采用有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體萃取法[3]、罐組式逆流提取法等[4-5]，浸提-減壓蒸餾工藝[6]，揮發(fā)油提取率能顯著提高，但存在著諸多不足，如需要特殊工業(yè)設(shè)備、存在有機(jī)溶劑殘留、生產(chǎn)成本過(guò)高等缺點(diǎn)。

氯化鈉對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油在水中溶解度有降低作用，故能提高其揮發(fā)油提取率。在此實(shí)驗(yàn)中，氯化鈉加入量為主要影響因素，其次是蒸餾時(shí)間，然后是液料比，蒸餾時(shí)間及液料比對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響不大。

《中國(guó)藥典》揮發(fā)油測(cè)定法中，揮發(fā)油的蒸餾時(shí)間一般約為5 h[7]。對(duì)于當(dāng)歸這一具體品種，根據(jù)揮發(fā)油的得率及藁本內(nèi)酯的含量綜合指標(biāo)，考慮當(dāng)歸揮發(fā)油提取時(shí)間定為8 h為宜[8]。

藁本內(nèi)酯是不穩(wěn)定物質(zhì)，易發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)[9]，本研究以藁本內(nèi)酯為考察指標(biāo)研究其提取工藝，是因?yàn)檗槐緝?nèi)酯正是賦予當(dāng)歸揮發(fā)油香味特征和主要功效的成分。由當(dāng)歸揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯的含量與原藥中所含藁本內(nèi)酯含量的比較結(jié)果來(lái)看，藁本內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率僅為67.1%。水蒸氣蒸餾過(guò)程中的體系及高溫過(guò)程必將加速這一異構(gòu)化反應(yīng)過(guò)程。

不同地區(qū)當(dāng)歸揮發(fā)油的提取量存在差異，這可能是由于氣候環(huán)境、栽培方式、土壤成分差異有所不同導(dǎo)致的[10]。揮發(fā)油收率多少并不能簡(jiǎn)單說(shuō)明藥物會(huì)對(duì)藥理、藥效產(chǎn)生不同的作用，更加深入的結(jié)論有待進(jìn)一步研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：124-125.

[2] 李家仁.中國(guó)當(dāng)歸化學(xué)成分的研究[J].中草藥，1983，18(4)：41-42.

[3] 李菁，葛發(fā)歡，黃曉芬，等.超臨界CO2萃取當(dāng)歸揮發(fā)油的研究[J].中藥材，1996，4(4)：187-189.

[4] 梁忠明.試述中藥提取工藝和新進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1993，4(4)：36-38.

[5] 黃保民.中藥提取分離工藝中高新技術(shù)應(yīng)用的進(jìn)展[J].中醫(yī)研究，1998，11(5)：56-58.

[6] 鄭春生，姚寶書，李梅.當(dāng)歸揮發(fā)油提取工藝研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3(1)：32-34.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄63.

[8] 李桂生，劉巖，劉珂.水蒸氣蒸餾法對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油提取過(guò)程中成分異構(gòu)化的影響[J].中成藥，2001，23(11)：784-786.

[9] 胡長(zhǎng)鷹.當(dāng)歸揮發(fā)油的提取與成分分析[J].食品與機(jī)械，2006，22(2)：24-26.

[10] 丁潔，趙國(guó)虎，趙象祿，等.岷縣當(dāng)歸揮發(fā)油成分產(chǎn)地差異及提取工藝研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，8(4)：139-144.

OptimizetheTechniqueofExtractingVolatileOilfromAngelicasinensisbySteamDistillation

ZHENG Wei-ran1，2，TAO Yong-hua1，2，SHI Jing1，2，SHAO Jie1，2，XIAO Wei1，2*

(1.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.，Ltd.，Lianyungang222001，China;2.StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalProcessNew-techforChineseMedicine，JiangsuLianyungang222001，China)

Objective：To study volatile oil extraction process fromAngelicasinensisby orthogonal experiment.Methods：Using the oil rate as an index，the dosage of solvent，the extraction time，and the dosage of sodium chloride as the orthogonal factors.Results：The optimum extraction process as follows：six times volumes water，extracting time 8 h，the dosage of sodium chloride being one fifth of the medicine，the oil rate was of 0.4%.Conclusion：The extraction process is reasonable，feasible and stable.

Angelicasinensis；Volatile oil；Ligusiilide；Extraction process

2013-03-14)

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國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)——現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)(2013ZX09402203)

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蕭偉，研究員級(jí)高級(jí)工程師，主要研究方向：中藥新制劑的研究與開(kāi)發(fā)，Tel：(0518)85521956，E-mail：wzhzh-nj@tom.com