王超，裴彩云，王宗權(quán)，宋劍，賈繼明

(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035)

HPLC測定吐根中吐根堿和吐根酚堿的含量

王超，裴彩云，王宗權(quán)，宋劍*，賈繼明

(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035)

目的：建立吐根中吐根堿和吐根酚堿含量測定的方法，為該藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05%三乙胺(40∶60)；檢測波長：283 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果：吐根堿和吐根酚堿在HPLC中分離良好，且兩種生物堿在1.0～10.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，平均回收率分別為95.8%，96.6%，RSD分別為1.2%，1.5%。3批吐根藥材中吐根堿含量為0.93～0.98 mg·g-1；吐根酚堿的含量為1.43～1.48 mg·g-1。結(jié)論：利用高效液相色譜對吐根中吐根堿和吐根酚堿進(jìn)行含量測定，方法簡便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于吐根堿和吐根酚堿的含量測定。

含量測定；吐根堿；吐根酚堿；吐根；高效液相色譜

吐根為茜草科植物Cephaelisipecacuanha(Brot.)A.Rich.或C.acuminataKarsten的干燥根及根莖。主產(chǎn)巴西，我國廣東、云南、臺灣有引種栽培，用作抗阿米巴藥、鎮(zhèn)咳劑(祛痰)、催吐劑，常在止咳藥處方中出現(xiàn)。吐根主要活性成分為生物堿，其中吐根酚堿、吐根堿占藥材生物堿總量的90%，均為異喹啉型生物堿。《歐洲藥典》(EP)、《美國藥典》(USP)和《日本藥局方》(JP)[1-3]均有收載。吐根具有一定的毒性，其毒性成分和治療成分都是以鹽酸吐根堿和鹽酸吐根酚堿為主的總生物堿，常用的測定方法為滴定法、顯色法等，缺少對成分的精確控制[4-5]。為了能更有效控制其質(zhì)量，作者采用高效液相色譜法對吐根藥材的藥用部位進(jìn)行吐根酚堿、吐根堿的含量測定。

1 儀器與試劑

美國Waters 2695型高效液相色譜儀；KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率33 kHz),BS2202S電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

乙腈、三乙胺(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)為色譜純，其余試劑均為分析純。鹽酸吐根酚堿對照品(International Laboratory USA公司，批號：325166)，鹽酸吐根堿對照品(美國Sigma 公司，批號：061M1826V)，吐根藥材為市售產(chǎn)品(產(chǎn)地：巴西)，經(jīng)河北省藥品檢驗所孫寶惠主任中藥師鑒定為Cephaelisipecacuanha(Brot.)A.Rich.的根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

精密稱取鹽酸吐根酚堿、鹽酸吐根堿對照品適量，用乙腈溶解，分別制成0.20 mg·mL-1溶液作為鹽酸吐根酚堿、鹽酸吐根堿對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取吐根藥材5 g于300 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇100 mL，1 mL鹽酸，密塞，稱定重量。超聲提取1 h，放冷，用70%乙醇補足失去的重量，搖勻、離心過濾，濾液用水定容至100 mL，記為A，取50 mL備用。將濾液A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，加水至30 mL，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH到10，用乙醚萃取3次，用量1∶1，收集乙醚層，水浴揮干溶劑，殘渣用乙腈溶解并定容至25 mL，取1 mL，用乙腈稀釋并定容至10 mL，記為B。將A、B過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液測定。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-0.05%三乙胺(40∶60)，使用前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾并脫氣；檢測波長：283 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)以吐根酚堿計不少于6 000。

在此條件下，對照品、供試品溶液的色譜圖如圖1所示，光譜圖如圖2所示。

A.吐根酚堿對照品 B.吐根堿對照品 C.吐根藥材a.吐根酚堿 b.吐根堿圖1 吐根藥材及對照品HPLC圖

A.吐根酚堿對照品 B.吐根堿對照品 C.吐根藥材圖2 吐根藥材及對照品光譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取吐根酚堿對照品溶液4，8，12，16，20 μL注樣分析，以X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸，同法操作吐根堿對照品溶液，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。吐根酚堿回歸方程為Y=1.536×10-4X+0.247，r=0.999 3;吐根堿回歸方程為Y=1.304×10-4X+0.651，r=0.999 6，說明吐根酚堿和吐根堿質(zhì)量濃度在1.0～10.0 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗 按2.2方法制備1份樣品，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，按上述色譜條件測定峰面積，結(jié)果吐根酚堿、吐根堿峰面積積分值的RSD分別為1.18%和1.03%，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 按2.2方法制備1份樣品，分別于0，2，4，6，8 h精密吸取20 μL，按2.3色譜條件測定，記錄峰面積積分值，結(jié)果吐根酚堿、吐根堿峰面積積分值的RSD分別為2.39%和2.43%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同批樣品5份，按2.2方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件測定，結(jié)果吐根酚堿、吐根堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.45%，2.38%，表明重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的同批樣品，稱重6份，分別精密加入一定量的吐根酚堿和吐根堿對照品，按2.2方法制備樣品并按上述色譜條件測定，結(jié)果見表1、表2。

表1 吐根中吐根酚堿的加樣回收率試驗

表2 吐根中吐根堿加樣回收率試驗

2.5 樣品含量測定

按供試品制備方法制備得3批提取物(批號：120501，120502，120503)的供試品溶液。對照品溶液及供試品溶液按上述色譜條件測定，按吐根酚堿、吐根堿的峰面積，外標(biāo)法計算吐根酚堿、吐根堿的含量，結(jié)果見表3。

表3 吐根中吐根堿和吐根酚堿含量測定結(jié)果 /mg·g-1

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

比較了酸水提取、酸醇提取吐根生物堿，結(jié)果表明70%乙醇和適量鹽酸的提取效果更好。

3.2 純化方法考察

考察了大孔吸附樹脂純化生物堿、離子交換樹脂純化生物堿、有機(jī)溶劑萃取生物堿、酸堿沉淀法純化生物堿。結(jié)果大孔吸附樹脂法、離子交換樹脂法及酸堿沉淀法純化生物堿轉(zhuǎn)移率低，且純度低，不利于吐根酚堿、吐根堿的進(jìn)一步分離純化。有機(jī)溶劑萃取法轉(zhuǎn)移率高、且生物堿純度高。

3.3 不同pH對純化的影響

通過調(diào)節(jié)不同pH值8、9、10、11考察了pH對生物堿分離的影響，結(jié)果表明pH為10以上時，分離純化效果好，轉(zhuǎn)移率高。

3.4 檢測波長選擇

對吐根生物堿對照品溶液及供試品溶液在波長200～400 nm進(jìn)行掃描，均在(283±1)nm內(nèi)有最大吸收，因此選283 nm為檢測波長。

4 小結(jié)

從方法學(xué)驗證可以看出建立的HPLC方法有良好的線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率，證明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于吐根藥材中生物堿含量測定。

[1] Strasbourg,France:European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia[S].2010: 1155-1156.

[2] Rockville,USA:The United States Pharmacopeial Conventio. USA Pharmacopoeia(USP32-NF27)[S].2009: 2682.

[3] Tokyo，Japan：Society of Japanese Pharmacopoeia.The Japanese Pharmacopoeia[S].2006: 1303.

[4] 許立穎，宋偉峰.吐根醚溶性生物堿提取工藝研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011,8(11)：60-61.

[5] 伊藤篤子.吐根的生物堿成分[J].國外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊，1992,21(6)：26

DeterminationofEmetineandCephaelineinCephaelisipecacuanhabyHPLC

WANG Chao，PEI Cai-yun，WANG Zong-quan，SONG Jian*，JIA Ji-ming

(ShijiazhuangYilingPharmaceuticalCo.，Ltd.，Shijiazhuang050035，China)

Objective：To establish a method for the determination of emetine and cephaeline inCephaelisipecacuanhaby HPLC.Methods：A ZORBAX Eclipse C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)was used with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.05% triethylamine (40∶60).The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detective wavelength was 283 nm.Column temperature was room temperature and the injection volume was 10 μL.Results：Two alkaloids were separated well，the calibration curves showed good linear response over the range from 1.0 to 10.0 μg·mL-1for the two alkaloids.The mean recoveries rate were 95.8% (RSD=1.2%，n=6)and 96.6% (RSD=1.5%，n=6)respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used forCephaelisipecacuanhaquality control.

Determination；Emetine；Cephaeline；Cephaelisipecacuanha；HPLC

2013-02-16)

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宋劍，碩士，副主任中藥師，主要從事中藥新藥研發(fā)工作,E-mail：songjian@yiling.cn