李海燕，趙雪艷

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州450003;2.河南羚銳制藥股份有限公司，河南信陽(yáng)464000)

丹鹿通督片由丹參、鹿角膠、黃芪、延胡索、杜仲等藥材組成，具有活血通督、益腎通絡(luò)的功效，用于腰椎管狹窄癥(黃韌帶增厚、椎體退行性改變、陳舊性椎間盤(pán)突出)屬瘀阻督脈型所致的間歇性跛行、腰腿疼痛、活動(dòng)受限、下肢酸脹疼痛、舌質(zhì)暗或有瘀斑等癥的治療。丹鹿通督片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》［1］第85冊(cè)，原標(biāo)準(zhǔn)操作較繁瑣，且不能對(duì)藥品進(jìn)行有效質(zhì)量控制。筆者根據(jù)處方所含藥味的化學(xué)成分及劑型特點(diǎn)，研究修訂了丹參、黃芪的薄層色譜鑒別，修訂了黃芪中黃芪甲苷［2］的含量測(cè)定方法，全面提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以便更好地控制藥品質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

丹鹿通督片，河南羚銳制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào) 1202201，1202202，120214。丹參、黃芪、延胡索對(duì)照藥材(批號(hào)依次為 120923－200610，120974 －200609，120928－200604)及丹參酮ⅡA、延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)依次為110766－200518，110726－200610)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781－200613，供含量測(cè)定用)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇、乙腈為色譜純;水為樂(lè)百氏純凈水;其他試劑均為分析純。Waters 2690高效液相色譜儀－蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Alltech ELSD 2000ES)，產(chǎn)地美國(guó);硅膠G預(yù)制薄層板，青島海洋化工廠產(chǎn)品;KQ－300型超聲波清洗機(jī)，功率 250 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹 參

方法參照文獻(xiàn)［3］。取本品研細(xì)，稱取2 g，加乙醚20 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取處方中除丹參外的其他藥物，按丹鹿通督片制備工藝制備，制成缺丹參陰性對(duì)照藥，同法制成缺丹參陰性對(duì)照溶液。另取丹參對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(10∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn);缺丹參陰性對(duì)照品色譜中，在相對(duì)應(yīng)的位置無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 丹參薄層鑒別色譜圖

2.1.2 黃 芪

方法參照文獻(xiàn)［4］。取本品20片，除去包衣，研細(xì)，稱取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中;精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量;加熱回流2 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量;搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干;殘?jiān)铀?0 mL微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液;用氨試液洗滌2次，每次50 mL;棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，搖勻，作為供試品溶液。取處方中除黃芪外其他藥物，按丹鹿通督片制備工藝制成缺黃芪陰性對(duì)照藥，同法制成缺黃芪陰性對(duì)照溶液。另取黃芪對(duì)照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。再取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照藥材及對(duì)照品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丙酮－水(5∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液，置105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺黃芪陰性對(duì)照色譜中，在相對(duì)應(yīng)的位置無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪薄層鑒別色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為 Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫為 35 ℃，流動(dòng)相為乙腈 － 水(34∶66)［5］，體積流量為 1 mL/min，載氣體積流量2.3 L/min，供試品進(jìn)樣體積 15 μL，對(duì)照品進(jìn)樣體積10 μL 及 20 μL，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度105℃。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。色譜見(jiàn)圖3。

2.2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液:取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升含0.2 mg的溶液，即得。供試品溶液:取2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液作為供試品溶液。陰性溶液:按丹鹿通督片處方中比例稱取除黃芪外的其他藥物，按丹鹿通督片制備工藝制備缺黃芪陰性對(duì)照藥，按供試品溶液制備方法制得缺黃芪陰性對(duì)照品溶液。

圖3 丹鹿通督片高效液相色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.195 5 g/L)5，7，10，15，25，30 μL，按上述色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=2 044 106.882X－1 305 814.604(r=0.999 3)。結(jié)果表明:黃芪甲苷在0.977 5 ～5.865 0 μg 線性良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為2.2%。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)為120214)，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定黃芪甲苷的含量，結(jié)果RSD為2.0%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0，2，4，6，8，10 h 注入液相色譜儀，測(cè)定黃芪甲苷峰面積積分值。結(jié)果示峰面積的RSD為2.6%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的本品(批號(hào)為120214，黃芪甲苷含量1.028 8 mg/g)約1 g，精密加入質(zhì)量濃度為0.977 4 g/L的黃芪甲苷對(duì)照品甲醇溶液1 mL，再精密加入甲醇溶液50 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測(cè)定黃芪甲苷含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 樣品含量測(cè)定

按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定3批丹鹿通督片中黃芪甲苷的含量，平行測(cè)定2次，結(jié)果見(jiàn)下表2。

表2 3批樣品黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

驗(yàn)證原標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn):丹參、杜仲［6］色譜效果不理想，黃芪薄層色譜操作復(fù)雜。筆者把丹參色譜中展開(kāi)劑改為石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯(10∶2)，結(jié)果Rf值適中，薄層效果較好;把黃芪色譜中供試品溶液的制備方法改為與修訂后的含量測(cè)定方法一致，結(jié)果簡(jiǎn)化了操作過(guò)程且薄層效果較好;對(duì)杜仲［7］的薄層色譜進(jìn)行了多種提取方法的研究，結(jié)果均不理想，建議刪去杜仲的薄層色譜項(xiàng);驗(yàn)證了原標(biāo)準(zhǔn)中延胡索的薄層色譜檢查，原方法薄層效果較好，未改動(dòng)。采用HPLC-ELSD法進(jìn)行了黃芪中黃芪甲苷［8］的含量測(cè)定，豐富了藥品的定性定量指標(biāo)，比較了原標(biāo)準(zhǔn)中TLCS法與HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷的含量，結(jié)果HPLC-ELSD法測(cè)定的黃芪甲苷含量比TLCS法測(cè)定的含量高10%以上，提取較完全，提取方法簡(jiǎn)便可控，可確保藥品的安全有效性。

在丹鹿通督片含量測(cè)定研究過(guò)程中，曾比較了超聲提取、加熱回流及索氏提取等不同方法制備供試品溶液，結(jié)果超聲提取不能提取完全，回收率不符合規(guī)定，而加熱回流比索氏提取操作簡(jiǎn)便，因此選用加熱回流的方法制備供試品溶液?？疾炝斯┰嚻诽崛∵^(guò)程中氨試液洗滌的時(shí)間不同，黃芪甲苷含量差別較大的問(wèn)題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氨試液洗滌，每次洗滌時(shí)間在2 h以上時(shí)，黃芪甲苷提取完全且含量穩(wěn)定。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn):第85冊(cè)［S］.1997:92.

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