李海燕，趙雪艷

(1.河南省食品藥品檢驗所，河南鄭州450003;2.河南羚銳制藥股份有限公司，河南信陽464000)

丹鹿通督片由丹參、鹿角膠、黃芪、延胡索、杜仲等藥材組成，具有活血通督、益腎通絡(luò)的功效，用于腰椎管狹窄癥(黃韌帶增厚、椎體退行性改變、陳舊性椎間盤突出)屬瘀阻督脈型所致的間歇性跛行、腰腿疼痛、活動受限、下肢酸脹疼痛、舌質(zhì)暗或有瘀斑等癥的治療。丹鹿通督片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》［1］第85冊，原標(biāo)準(zhǔn)操作較繁瑣，且不能對藥品進行有效質(zhì)量控制。筆者根據(jù)處方所含藥味的化學(xué)成分及劑型特點，研究修訂了丹參、黃芪的薄層色譜鑒別，修訂了黃芪中黃芪甲苷［2］的含量測定方法，全面提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以便更好地控制藥品質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

丹鹿通督片，河南羚銳制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號 1202201，1202202，120214。丹參、黃芪、延胡索對照藥材(批號依次為 120923－200610，120974 －200609，120928－200604)及丹參酮ⅡA、延胡索乙素對照品(批號依次為110766－200518，110726－200610)、黃芪甲苷對照品(批號110781－200613，供含量測定用)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇、乙腈為色譜純;水為樂百氏純凈水;其他試劑均為分析純。Waters 2690高效液相色譜儀－蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech ELSD 2000ES)，產(chǎn)地美國;硅膠G預(yù)制薄層板，青島海洋化工廠產(chǎn)品;KQ－300型超聲波清洗機，功率 250 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹 參

方法參照文獻［3］。取本品研細(xì)，稱取2 g，加乙醚20 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取處方中除丹參外的其他藥物，按丹鹿通督片制備工藝制備，制成缺丹參陰性對照藥，同法制成缺丹參陰性對照溶液。另取丹參對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(10∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點;缺丹參陰性對照品色譜中，在相對應(yīng)的位置無干擾。見圖1。

圖1 丹參薄層鑒別色譜圖

2.1.2 黃 芪

方法參照文獻［4］。取本品20片，除去包衣，研細(xì)，稱取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中;精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量;加熱回流2 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量;搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干;殘渣加水30 mL微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液;用氨試液洗滌2次，每次50 mL;棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，作為供試品溶液。取處方中除黃芪外其他藥物，按丹鹿通督片制備工藝制成缺黃芪陰性對照藥，同法制成缺黃芪陰性對照溶液。另取黃芪對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照藥材及對照品溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丙酮－水(5∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液，置105℃烘至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺黃芪陰性對照色譜中，在相對應(yīng)的位置無干擾。見圖2。

圖2 黃芪薄層鑒別色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為 Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫為 35 ℃，流動相為乙腈 － 水(34∶66)［5］，體積流量為 1 mL/min，載氣體積流量2.3 L/min，供試品進樣體積 15 μL，對照品進樣體積10 μL 及 20 μL，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度105℃。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于6 000。色譜見圖3。

2.2.2 溶液的制備

對照品溶液:取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升含0.2 mg的溶液，即得。供試品溶液:取2.1.2項下的供試品溶液作為供試品溶液。陰性溶液:按丹鹿通督片處方中比例稱取除黃芪外的其他藥物，按丹鹿通督片制備工藝制備缺黃芪陰性對照藥，按供試品溶液制備方法制得缺黃芪陰性對照品溶液。

圖3 丹鹿通督片高效液相色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(0.195 5 g/L)5，7，10，15，25，30 μL，按上述色譜條件測定。以進樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=2 044 106.882X－1 305 814.604(r=0.999 3)。結(jié)果表明:黃芪甲苷在0.977 5 ～5.865 0 μg 線性良好。

2.2.4 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液，進樣10 μL，重復(fù)進樣6次，結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為2.2%。

2.2.5 重復(fù)性試驗

取同一批樣品(批號為120214)，平行制備6份供試品溶液，測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果RSD為2.0%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0，2，4，6，8，10 h 注入液相色譜儀，測定黃芪甲苷峰面積積分值。結(jié)果示峰面積的RSD為2.6%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的本品(批號為120214，黃芪甲苷含量1.028 8 mg/g)約1 g，精密加入質(zhì)量濃度為0.977 4 g/L的黃芪甲苷對照品甲醇溶液1 mL，再精密加入甲醇溶液50 mL，按2.2.3項下方法制備加樣供試品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測定黃芪甲苷含量，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.8 樣品含量測定

按2.2.3項下方法制備供試品溶液，測定3批丹鹿通督片中黃芪甲苷的含量，平行測定2次，結(jié)果見下表2。

表2 3批樣品黃芪甲苷含量測定結(jié)果

3 討論

驗證原標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn):丹參、杜仲［6］色譜效果不理想，黃芪薄層色譜操作復(fù)雜。筆者把丹參色譜中展開劑改為石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯(10∶2)，結(jié)果Rf值適中，薄層效果較好;把黃芪色譜中供試品溶液的制備方法改為與修訂后的含量測定方法一致，結(jié)果簡化了操作過程且薄層效果較好;對杜仲［7］的薄層色譜進行了多種提取方法的研究，結(jié)果均不理想，建議刪去杜仲的薄層色譜項;驗證了原標(biāo)準(zhǔn)中延胡索的薄層色譜檢查，原方法薄層效果較好，未改動。采用HPLC-ELSD法進行了黃芪中黃芪甲苷［8］的含量測定，豐富了藥品的定性定量指標(biāo)，比較了原標(biāo)準(zhǔn)中TLCS法與HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果HPLC-ELSD法測定的黃芪甲苷含量比TLCS法測定的含量高10%以上，提取較完全，提取方法簡便可控，可確保藥品的安全有效性。

在丹鹿通督片含量測定研究過程中，曾比較了超聲提取、加熱回流及索氏提取等不同方法制備供試品溶液，結(jié)果超聲提取不能提取完全，回收率不符合規(guī)定，而加熱回流比索氏提取操作簡便，因此選用加熱回流的方法制備供試品溶液?？疾炝斯┰嚻诽崛∵^程中氨試液洗滌的時間不同，黃芪甲苷含量差別較大的問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氨試液洗滌，每次洗滌時間在2 h以上時，黃芪甲苷提取完全且含量穩(wěn)定。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn):第85冊［S］.1997:92.

［2］高建，夏泉，黃趙剛，等.HPLC-ELSD同時測定當(dāng)歸補血總苷中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ［J］.中成藥，2012，34(2):268.

［3］鄭黎花，張慧，張利.川產(chǎn)丹參炒制工藝優(yōu)選及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，5(3):20.

［4］汪祺，張聿梅，戴忠，等.黃芪中氨基酸、黃酮類成分的特征薄層圖譜鑒別［J］.中國藥事，2012，26(1):50.

［5］汪冰，尤慧蓮，徐麗華.HPLC法測定芪參膠囊中5種化學(xué)成分［J］.中成藥，2012，33(3):483.

［6］陳彩娟，沈舒，肖同書，等.杜仲化學(xué)成分研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8(3):25.

［7］李欣，劉嚴(yán)，朱文學(xué)，等.杜仲的化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(10):378.

［8］韓景蘭，李太紅.復(fù)方紫貝液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中醫(yī)研究，2007，20(12):10.