黃駿 陳維 李輝 王鵬業(yè) 楊思澤2)

1 引言

近幾年來(lái),大氣壓冷等離子體射流及其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究正獲得越來(lái)越多的關(guān)注[1-15],尤其癌癥治療這個(gè)醫(yī)學(xué)難題已成為等離子體醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)持續(xù)的研究熱點(diǎn).子宮頸癌是嚴(yán)重危害全球婦女健康的主要惡性腫瘤之一[16],發(fā)病率僅次于乳腺癌,高居?jì)D女惡性腫瘤的第二位,每年全世界約有50萬(wàn)新發(fā)病例,將近29萬(wàn)死亡病例[17].其中,約80%的宮頸癌患者在發(fā)展中國(guó)家[18].我國(guó)是子宮頸癌的高發(fā)區(qū),每年新發(fā)病例約占全球新發(fā)病例總數(shù)的1/3[19],其中約有3萬(wàn)人死于宮頸癌[20].目前,子宮頸癌常規(guī)的治療方式中,外科手術(shù)雖然是一種有效措施,但絕大多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期,化療成為最主要的治療手段,雖然在一定程度上能提高宮頸癌患者的緩解率[21],但其不具有針對(duì)性,在殺滅惡性腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)無(wú)選擇性地?fù)p害大量正常細(xì)胞,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的毒副作用和耐藥性,導(dǎo)致仍有部分患者臨床療效難盡人意.而利用大氣壓冷等離子體射流滅活癌細(xì)胞具有相對(duì)靶向性強(qiáng)、操作靈活、療效確切、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),使其在癌癥治療的道路上成為一種潛在的新方法.本文研究了大氣壓冷等離子體射流對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的滅活作用,探討了活性氣體氧氣在惰性氣體氬氣中的百分含量對(duì)Hela癌細(xì)胞滅活效率的影響,并揭示了大氣壓冷等離子體射流對(duì)Hela癌細(xì)胞的滅活機(jī)制.

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 裝置

本文使用的大氣壓冷等離子體射流裝置的結(jié)構(gòu),如圖1所示.等離子體射流裝置主要由兩個(gè)電極、聚四氟乙烯固定器、石英管(內(nèi)徑6 mm,外徑8 mm)和橡皮塞組成.一根不銹鋼細(xì)管(內(nèi)徑0.9 mm,外徑1.6 mm)作為內(nèi)電極與電源高壓端相連,被橡皮塞和聚四氟乙烯固定器固定在石英管的中心.銅箔(寬度5 mm)作為外電極與地線連接,包裹在石英管下部漏斗型噴嘴處(內(nèi)徑從6 mm到1 mm),銅箔下端距離管口5 mm.工作氣體氬氣從石英管側(cè)壁通入,而活性氣體氧氣從不銹鋼細(xì)管頂端注入.如圖2所示,為大氣壓冷等離子體射流處理Hela癌細(xì)胞的實(shí)物圖.用峰值電壓為30 kV,頻率變化范圍在8—40 kHz的交流電源(CTP2000)產(chǎn)生等離子體射流,作用于接種在96孔板底部的Hela細(xì)胞.

圖1 大氣壓冷等離子體射流裝置結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 大氣壓冷等離子體射流處理Hela癌細(xì)胞的實(shí)物圖

2.2 樣品制備

將Hela細(xì)胞用含10%胎牛清和密理博高糖培養(yǎng)基(DMEM)在37°C,5%CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài),消化細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整為4000個(gè)/孔,把培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞株接種到微量滴定96孔板中,隨后加入2 mm厚度DMEM繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行等離子體處理.

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)培養(yǎng)后的子宮頸癌Hela細(xì)胞株樣品先進(jìn)行等離子體處理,隨后利用中性紅檢測(cè)其活性.實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈滅菌20—30 min.處理時(shí)保持氬氣流量在900 mL/min,維持功率在18 W,將等離子體射流裝置插入96孔板對(duì)應(yīng)孔中,讓噴嘴口與DMEM培養(yǎng)基液面距離保持1 mm,打開電源進(jìn)行放電處理.該參數(shù)條件下的等離子體按處理時(shí)間梯度30,60,90,120,150,180 s和添加的氧氣含量梯度9,18,36,72 mL/min分別進(jìn)行處理,對(duì)照組僅用氬/氧氣流不開電源進(jìn)行處理,同一組參數(shù)對(duì)應(yīng)三個(gè)樣品.處理后封口,在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,觀察不同等離子體處理?xiàng)l件下的Hela細(xì)胞形態(tài).隨后吸走DMEM培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞三次,輕柔拍打孔板,去除沖洗溶液.每孔加入中性紅的培養(yǎng)液,在37°C,5%CO2和濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞3 h.去除中性紅的培養(yǎng)液,每孔用PBS沖洗細(xì)胞一次,輕輕倒出并吸干全部的PBS,加入中性紅的裂解液.在微量滴定平板振蕩器上快速震蕩微量滴定96孔板10 min,直至中性紅從細(xì)胞內(nèi)被提取出來(lái),并形成均勻溶液.用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在540 nm波長(zhǎng)處的光密度,用空白孔作為參考對(duì)照.

3 結(jié)果和討論

3.1 I-V曲線

利用高壓探頭(Tektronix P6015 A)測(cè)量加在大氣壓冷等離子體射流裝置上的電壓,利用電流探頭(Tektronix P6021)實(shí)時(shí)測(cè)量通過(guò)反應(yīng)器的電流,輸出信號(hào)由示波器(Tektronix TDS 210)收集.圖3是氬/氧等離子體射流裝置放電的電壓-電流波形圖.從圖可知,電壓是正弦曲線,放電電流波形由準(zhǔn)正弦的位移電流和眾多窄脈沖的微放電電流疊加而成,并且隨著放電電壓的波形呈現(xiàn)周期性變化,這是典型的絲狀放電模式.

圖3 氬-氧等離子體射流裝置放電電壓-電流波形圖(氬氣流量為900 mL/min,氧氣流量為18 mL/min;1為電壓曲線,2為電流曲線)

3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖4 等離子體處理后Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 (a)對(duì)照組;(b)900 mL/min氬氣;(c)900 mL/min氬氣添加18 mL/min氧氣

等離子體處理后24 h,在倒置顯微鏡下對(duì)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)及形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察,如圖4所示.圖4(a)是未經(jīng)等離子體處理的對(duì)照組細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)正常,呈紡錘形或多角形,輪廓清晰,邊界清楚,透明度高,立體感較強(qiáng),細(xì)胞緊密貼壁,融合成片,生長(zhǎng)旺盛.圖4(b)為900 mL/min氬氣等離子體處理Hela細(xì)胞90 s后的照片.部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,出現(xiàn)不同大小的圓形細(xì)胞,且胞內(nèi)開始出現(xiàn)顆粒.圖4(c)為900 mL/min氬氣添加18 mL/min氧氣等離子體處理Hela細(xì)胞90 s后的照片,絕大部分細(xì)胞輪廓趨于模糊,立體感降低,細(xì)胞體積明顯縮小,并且呈顆粒狀崩解,出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象.

3.3 中性紅染色

圖5為利用中性紅吸收測(cè)試在氬/氧等離子體處理后24 h測(cè)定的Hela細(xì)胞存活率曲線.圖中縱坐標(biāo)為處理后Hela細(xì)胞的光密度值(OD值)的平均值(在相同參數(shù)條件下,處理三組細(xì)胞)與對(duì)照組OD0值(三組未經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞)平均值的比,橫坐標(biāo)為等離子體處理Hela癌細(xì)胞的時(shí)間.如圖5所示,單純用氬等離子體處理的效果不如氬/氧等離子體的處理效果,在相同的處理時(shí)間下,添加2%氧氣的氬等離子體對(duì)Hela細(xì)胞的滅活效果最好,在180 s處理時(shí)間后,Hela細(xì)胞存活率已降低至7%.然而,當(dāng)氧氣含量持續(xù)增加超過(guò)2%時(shí),滅活Hela細(xì)胞的效果會(huì)有所減弱,直至增加到8%時(shí),其效率甚至不如單獨(dú)的氬氣等離子體.

圖5 氧氣含量與處理時(shí)間對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響

3.4 發(fā)射光譜測(cè)量

圖6 OH(309 nm),Ar(774 nm),O(844 nm)相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度分布與氧氣含量的關(guān)系

圖6 為OH(309 nm),Ar(774 nm),O(844 nm)發(fā)射光譜相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度分布與氧氣含量的關(guān)系.在輸入功率為18 W,氬氣流量為900 mL/min的情況下,隨著氧氣含量的增加,OH(309 nm)和Ar(774 nm)的譜線強(qiáng)度逐漸減小.比較圖5和圖6可以發(fā)現(xiàn),Hela細(xì)胞的存活率與O(844 nm)的發(fā)射光譜強(qiáng)度成正比.當(dāng)氧氣流量為18 mL/min時(shí),即氧氣占?xì)鍤獾捏w積百分含量為2%時(shí),子宮頸癌Hela細(xì)胞的存活率最低,即等離子體的滅活效果最好,說(shuō)明O(844 nm)在大氣壓冷等離子體滅活過(guò)程中起著重要作用.添加活性氣體氧氣對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響在于：原本氬氣只能與大氣和周圍空氣中水蒸氣作用來(lái)產(chǎn)生氧自由基,我們?cè)趦?nèi)電極中通入氧氣,能夠使其在等離子體射流裝置的管口處與氬等離子體充分混合后再出去,因此有效增加了氧自由基的含量.然而,當(dāng)氧氣含量持續(xù)增加超過(guò)2%時(shí),滅活Hela細(xì)胞的效果會(huì)有所減弱,直至增加到8%時(shí),其效率甚至不如單獨(dú)的氬等離子體.這是由于隨著氧含量的不斷增加,過(guò)量氧氣可能會(huì)吸收大量電子,使得氣體總電離度隨之降低,從而導(dǎo)致等離子體內(nèi)氧自由基含量減少,影響了處理效果.

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種大氣壓冷等離子體射流裝置處理子宮頸癌Hela細(xì)胞.通過(guò)電流電壓探針研究了等離子體放電特性,發(fā)現(xiàn)氬/氧等離子體的放電模式為絲狀放電.在氬氣等離子體中添入不同百分含量的氧氣處理子宮頸癌Hela細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)添加2%氧氣時(shí),氬/氧等離子體滅活效果最佳,在180 s處理時(shí)間后,Hela細(xì)胞存活率已降低至7%.當(dāng)繼續(xù)添加氧氣超過(guò)2%時(shí),滅活效果逐漸減弱,直至8%時(shí),其效果反而不如單純氬氣等離子體.對(duì)等離子體發(fā)射光譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)隨著氧氣含量的增加,OH(309 nm)和Ar(774 nm)的譜線強(qiáng)度逐漸減小,而O(844 nm)譜線強(qiáng)度先增加后減小.Hela細(xì)胞的存活率與O(844 nm)的發(fā)射光譜強(qiáng)度成正比,這說(shuō)明在等離子體滅活Hela細(xì)胞過(guò)程中,活性氧自由基O(844 nm)起關(guān)鍵作用.

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