耿乃志，張碩辛，王曉麗，都曉偉，姜德友，柳成剛

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦得生口服液由三七、紅花、川芎、山楂、葛根等藥物組成，是純中藥復方制劑，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡、醒腦開竅的功效，臨床上用于腦動脈硬化、缺血性腦中風及腦出血后遺癥等。為了更好地控制該口服液的內(nèi)在質(zhì)量，確保用藥的安全有效，本研究采用薄層色譜法對制劑中的紅花、葛根、川芎進行了定性鑒別;采用高效液相色譜法測定制劑中君藥三七中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 W aters 600E－2487型高效液相色譜儀、Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢測器(美國 W aters公司);AG/35型電子天平。

1.2 試藥 三七皂苷 R1對照品(批號110745－200312)，人參皂苷 Rb1對照品(批號 110704－200420)、人參皂苷 Rg1對照品(批號 110703－200424)(中國藥品生物制品檢定所);腦得生口服液(本實驗室自制);硅膠G板(青島海洋化工廠);紅花、葛根、川芎對照藥材(中國藥品生物制品檢定所);三七、紅花、葛根、川芎、山楂藥材(哈爾濱市醫(yī)藥藥材公司);乙腈為色譜純;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 紅花 吸取腦得生口服液5ml，用乙酸乙醋萃取2 次(20ml，15ml)，合并萃取液，濃縮至1ml，即得供試品溶液。取缺紅花的其他4味藥材，按口服液制備工藝制成口服液，按供試品制備方法，制成不含紅花的陰性對照液。稱取紅花對照藥材1g，加水50ml水浴提取2h，放冷，過濾，用乙酸乙酯萃取 2次(20ml，15ml)，合并萃取液，濃縮至1ml，即得對照藥材溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)進行實驗，吸取供試品溶液，陰性對照液和紅花對照藥材溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯(11:6)為展開劑，展開，取出，晾干，用氨氣熏后，置于紫外燈(UV365)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的藍色斑點，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.2 葛根 取含量測定項下的供試品溶液為供試品溶液。取缺葛根的其他4味藥材按口服液制備工藝制成口服液，按供試品制備方法，制成不含葛根的陰性對照液。取葛根對照藥材2g，用相同的方法制成對照藥材溶液。另取葛根素對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版第一部附錄VIB)進行實驗，分別吸取供試品溶液，葛根對照品溶液，葛根對照藥材溶液和陰性對照液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿－乙酸乙酯－甲醇－水 (15:40:22:10)在10℃以下放置12h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。置于紫外燈下(365nm)檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.3 川芎 吸取腦得生口服液5ml，蒸干，加乙酸乙酯 －甲酸 (9.5:0.5)的混合液20ml，加熱回流4h，濾過，濾液蒸干后，殘渣加甲醇2ml使之溶解，作為供試品溶液。另取缺川芎的其他4味藥材按口服液制備工藝制成口服液，按供試品制備方法，制成不含川芎的陰性對照液。另取川芎對照藥材2g，加水50ml煎煮1h，放冷，濾過，濾液蒸干，同法制成對照藥材溶液。取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.5mg的對照品溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)進行實驗，吸取陰性對照液，供試品溶液，葛根對照藥材溶液及對照品溶液各5μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以苯－氯仿－甲醇(2:2:l)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下檢視，結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對照品和對照藥材色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照液色譜無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 腦得生口服液薄層色譜鑒別

2.2 人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.6mm ×200mm，5μm);乙腈－水作為流動相進行梯度洗脫，洗脫條件見表1;流速為1.0ml/min;柱溫為25℃;高純氮氣流速3.0L/min;漂移管溫度105℃。理論板數(shù)按照人參皂苷Rg1峰計算應不低于4 000。

表1 梯度洗脫流動相配比表

2.2.2 溶液的制備

對照品溶液的制備:分別精密稱取在105℃干燥至恒重的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1對照品適量，加甲醇配制成每毫升含人參皂苷Rg10.59mg、人參皂苷 Rb10.34mg、三七皂苷 R10.22mg的混合溶液，搖勻，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備:精密吸取口服液5ml，置于具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇萃取4次(30ml，20ml，20ml，15ml)，合并萃取液，精密吸取續(xù)濾液42.5ml，置于分液漏斗中，加氨試液洗滌3次(加入量分別為 20ml，15ml，10ml)，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾之后，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照液的制備:取缺三七的其他4味藥材，按口服液的制備方法制成口服液。精密吸取5ml，按供試品溶液的制備方法制成三七的陰性對照液。

2.2.3 線性關(guān)系考察

將對照品溶液以上述HPLC－ELSD法進行檢測，進樣量分別為 5μl、8μl、10μl、12μl、15μl、20μl。然后以進樣量微克數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標，吸收峰峰面積積分值的自然對數(shù)為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程分別為:Y=1.974 1X+9.967 8(r=0.999 4)。Y=1.859 8X+10.426 5(r=0.999 7);Y=1.779 8X+11.088 9(r=0.999 7)。結(jié)果表明，三七皂苷 R1在1.10 ～4.40μg，人參皂苷 Rg1在2.95 ～11.80μg，人參皂苷Rb1在1.70～6.80μg之間的線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液12μl，按上述色譜條件進行測定，連續(xù)進樣5次，并記錄峰面積，對照品峰面積積分值 RSD 分別為 0.2%，2.0%，2.1%，說明該方法精密度較高，測定可靠。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

吸取同一供試品溶液，于室溫條件下放置0、2、6、8、10h，按上述色譜條件測定。結(jié)果 RSD分別為2.6%，1.8%，2.5%，表明供試品溶液在 10h 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.6 重復性試驗

吸取同一批次的樣品，按照2.2.2項下的方法制備5份供試品溶液，測定峰面積并計算其含量。結(jié)果，RSD 分別為0.58%，0.39%，0.64%，表明該方法的重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗

精密吸取已知含量的同一批次腦得生口服液樣品5份，分別加入適量對照品溶液，然后按上述供試品溶液制備項下的方法制備成供試品溶液，測定其峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2～4。

表2 三七皂苷R1回收率表

表3 人參皂苷Rg1回收率表

表4 人參皂苷Rb1回收率表

2.2.8 含量測定

分別精密吸取三批不同批號的腦得生口服液，按供試品溶液的制備方法制備。精密吸取各供試液10μl，注入高效液相色譜儀，測定其峰面積。再把吸收峰峰面積積分值代入上述回歸方程，并計算含量，結(jié)果見表5。

表5 供試品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量測定結(jié)果(mg/ml，n=3)

3 討論

采用薄層色譜法對腦得生口服液中3味藥材進行了定性鑒別，結(jié)果表明，除被檢出藥材及對照品外，腦得生口服液中其他藥材對主斑點均無干擾，本方法專屬性強，操作簡便，重復性好，可以作為該制劑的定性控制指標。

原片劑和丸劑的標準中均使用紫外檢測器作為檢測手段，本研究經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)，由于檢測波長較低，在203nm處，梯度洗脫時基線漂移情況較嚴重，且待測成分峰并未達到完全基線分離。因而，本研究改用蒸發(fā)光散射檢測器，在此檢測條件下，待測成分峰基線達到完全分離，且基線漂移情況得到改善。經(jīng)實驗證實，該法具有操作簡便、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確等特點，可以用于該制劑的質(zhì)量控制。