齊鵬飛，李衛(wèi)華，何羽婷，趙 鵬，崔治中

（1．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安271018；2．中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島266032）

禽白血病病毒（ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科反轉(zhuǎn)錄病毒屬，可引起禽類(lèi)多種腫瘤性疾病。共10個(gè)亞群，其中 A、B、C、D、E、J存在雞群中［1］。1989年，白羽肉雞中發(fā)現(xiàn)了致病性和傳播能力都很強(qiáng)的ALV－J，給肉雞業(yè)造成巨大損失［2］。過(guò)去十幾年，ALV－J的發(fā)病日趨嚴(yán)重，蛋雞發(fā)病率也明顯增高，國(guó)內(nèi)有不少ALV－J誘發(fā)蛋雞腫瘤／血管瘤的報(bào)道［3－5］，多為單個(gè)病例。2010年山東某雞場(chǎng)暴發(fā)腫瘤性疾病，我們從6 000余只的群體中隨機(jī)抽取28只，做連續(xù)50d臨床病理觀察并逐只做病毒分離鑒定。

1 材料與方法

1．1 病雞來(lái)源 新泰某蛋雞場(chǎng)，飼養(yǎng)8 000余只海藍(lán)褐蛋雞，90日齡發(fā)病，臨床主要表現(xiàn)血管瘤，240日齡剩6 000余只。

1．2 觀察大體病變及剖檢 連續(xù)觀察病雞50d，記錄發(fā)病及死亡情況，最后剖檢。

1．3 病毒分離鑒定

1．3．1 病毒分離 采無(wú)菌抗凝血，血漿接種DF－1，2 h后換液維持7d檢測(cè)上清p27，確定是否外源ALV感染。

1．3．2 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA） p27陽(yáng)性細(xì)胞消化后接種于放有蓋玻片的平皿里培養(yǎng)9d，固定蓋玻片上細(xì)胞，ALV－J特異性單抗JE9［6］為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，熒光顯微鏡觀察。

1．3．3 模板DNA制備env基因擴(kuò)增及亞群確定DF－1接毒后維持7d，提取細(xì)胞DNA，擴(kuò)增env基因［7］。為確定病毒亞群，據(jù)參考文獻(xiàn)［8］，擴(kuò)增env基因的引物 F：5′－GGATGAGGTGACTAAGAAGG－3′；R：5′－ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT－3′，PCR 產(chǎn)物（預(yù)期大小約2．2kb）電泳回收純化，連接轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。DNAStar比較7個(gè)分離株與Gen－Bank中已發(fā)表的各亞群ALV的gp85氨基酸序列的同源性，確定亞群。比較同一毒株5個(gè)不同準(zhǔn)種。參考株基本信息見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2．1 病雞群長(zhǎng)期觀察及剖檢病理變化 35只雞因應(yīng)激等原因死亡7只，飼養(yǎng)中死亡7只，21只做了病毒分離。主要表現(xiàn)肝、脾腫大，白色增生性腫瘤結(jié)節(jié)。部分有肝臟或趾部血管瘤，15號(hào)左腿變粗并有腫瘤組織于胸骨下、腸系膜處。見(jiàn)表2。

表1 各亞群參考株基本信息

表2 病雞群長(zhǎng)期觀察及剖檢病理變化

2．2 病毒分離和鑒定 將病雞血漿接種DF－1后培養(yǎng)7d，檢測(cè)上清液p27均陽(yáng)性，表明這些雞均存在外源ALV感染。

2．3 IFA檢測(cè) 所有p27陽(yáng)性的細(xì)胞均顯示胞質(zhì)綠色熒光、胞核無(wú)熒光的典型感染（圖1）。確定分離到ALV－J，分別命名SDAU10C1－21（表2）。

圖1 SDAU10C1接種DF－1細(xì)胞培養(yǎng)9d后IFA結(jié)果

2．4env基因擴(kuò)增和gp85氨基酸序列同源性比較PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像儀下觀察分子量標(biāo)記2kb處有特異性條帶，約2．2kb，符合預(yù)期。gp85氨基酸序列同源性比較顯示，這7個(gè)分離株與ALV－J同源性最高，87．1%～95．5%，7個(gè)分離株間gp85同源性95．2%～98．2%（表3）。5個(gè)準(zhǔn)種間同源性98．1%～100%（表4）。

表3 SDAU10C1與各亞群參考株gp85氨基酸序列同源性比較

表4 SDAU10C1株五個(gè)準(zhǔn)種間gp85氨基酸序列同源性比較

3 討論

ALV－J是從肉雞中首次發(fā)現(xiàn)和分離鑒定的新亞群［2］。自2003年國(guó)內(nèi)首次報(bào)道蛋雞ALV－J越來(lái)越多的報(bào)道顯示，ALV－J在我國(guó)蛋雞中流行日趨嚴(yán)重［11］。商品代蛋雞的白血病會(huì)引發(fā)很高死淘率，帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)檫@種死亡通常發(fā)生在性成熟后開(kāi)始產(chǎn)蛋時(shí)［12］。由此，不斷引發(fā)商品代蛋雞場(chǎng)和種雞場(chǎng)糾紛。

本文對(duì)來(lái)自嚴(yán)重發(fā)生ALV－J誘發(fā)的腫瘤／血管瘤雞群的28只可疑病雞做了50d連續(xù)的臨床和病理觀察，顯示了多種多樣的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)變化，分 離到2 1株ALV－J。對(duì)7株克隆測(cè)序，gp 8 5氨基酸序列同源性與A～E亞群50．8%～52．7%，與J亞群86．9%～95．5%。與原型株 HPRS－103同源性95．0%，與另一原型株 ADOL－7501同源性86．9%，與海藍(lán)灰蛋雞分離株SD07LK1同源性92．6%?？梢?jiàn)，近年來(lái)ALV－J的gp85變異很快并發(fā)生了同源回歸［9－10］。這7株間同源性95．2%～98．2%，同一毒株5個(gè)準(zhǔn)種的同源性98．1%～100%，一定程度上說(shuō)明gp85有很高變異性。ALV－J引起的腫瘤形態(tài)多種多樣，有血管瘤、肝、脾增生性結(jié)節(jié)、骨硬化，有的無(wú)特征性腫瘤變化，僅表現(xiàn)消瘦。這些差異的產(chǎn)生可能與基因組變異性相關(guān)，也可能由個(gè)體差異引起。對(duì)一群可疑病雞做長(zhǎng)期逐日臨床病理觀察，國(guó)內(nèi)還是首次，有助于更深入地了解白血病的發(fā)病過(guò)程和病變多樣性。

HPRS－103是遲發(fā)型致瘤病毒。近年出現(xiàn)的一些毒株，自然感染情況下即可引發(fā)5周齡肉雞髓細(xì)胞 瘤，并 伴 隨 較 高 的 傳 染 性 和 發(fā) 病 率［12］。SDAU10C1人工感染后8d使不同日齡、品系雞發(fā)生腫瘤，是急性轉(zhuǎn)化型病毒。

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