王 雯 雯, 王 晗, 王 際 輝, 葉 淑 紅, 肖 珊

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

共軛脂肪酸是一類特殊的多不飽和脂肪酸。最常見的共軛脂肪酸為共軛亞油酸(CLA)和共軛亞麻酸(CLNA)。2001年,Suzuki等[1]利用高效液相色譜法,從桐油、石榴籽油等植物油中分離提純出多種CLNA的異構(gòu)體。研究發(fā)現(xiàn)CLNA具有比CLA更為顯著的抗癌能力,因此推測(cè)CLNA強(qiáng)烈的胞質(zhì)毒性是取決于其位置異構(gòu)而非順反異構(gòu),其抗癌機(jī)理可能與脂類過氧化有關(guān)[1-2]。對(duì)老鼠飼喂富含石榴酸的石榴籽油后,可以抑制其結(jié)腸癌和皮膚癌的發(fā)生[3-4]；此外,石榴籽油還能抑制人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞分化和通過Matrigel membrane誘導(dǎo)雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA的凋亡[5]。

目前石榴酸 (Punicic acid, PA) 對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響尚未有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)就是以α-亞麻酸為對(duì)照研究石榴酸對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡的影響,為癌癥的治療提供新的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

人膀胱癌細(xì)胞株T24,大連醫(yī)科大學(xué)提供；石榴酸,純度大于98%；Hoechst33342染色劑；Annexin V-PI試劑盒；四甲基偶氮唑鹽(MTT)。

CO2恒溫培養(yǎng)箱,倒置熒光顯微鏡,流式細(xì)胞儀,酶標(biāo)儀。

1.2 方 法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的T24細(xì)胞,胰酶消化制成每毫升含有2×107個(gè)細(xì)胞的懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h,細(xì)胞貼壁后,更換無胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)。用無水乙醇將α-LNA 和PA溶解。將不同濃度的 α-LNA (0、10、20、30、40、60 μmol/L)和PA (0、10、20、30、40、60 μmol/L) 分別加入對(duì)數(shù)期的細(xì)胞中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。5% CO2、37 ℃處理24 h,每孔加入20 μmol/L 的MTT溶液 10 μL,孵育3 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。各孔中加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)后振蕩10 min,使紫色結(jié)晶充分溶解。在OD570處使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的吸光值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度。

1.2.2 熒光染色凋亡細(xì)胞核形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的T24細(xì)胞,胰酶消化制成每毫升含有5×107個(gè)細(xì)胞的懸液,接種于24孔培養(yǎng)板,每孔500 μL。37 ℃、5% CO2孵育24 h,細(xì)胞完全貼壁展開后,更換無胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)。將不同濃度的α-LNA(0、10、20、30、40、60 μmol/L)和石榴酸(0、10、20、30、40、60 μmol/L)加入細(xì)胞中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,對(duì)照組只加入無水乙醇。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,在每孔中加入4 μg/mL Hoechst33342 500 μL,將其置于暗處染色10 min,最后利用熒光顯微鏡來觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析T24細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,制成每毫升含有5×107個(gè)細(xì)胞的懸液后接種于6孔板,每孔加入2 mL 的細(xì)胞懸液,接種后將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃的環(huán)境中孵育24 h,然后換成無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使細(xì)胞狀態(tài)均一。用不同濃度的PA (0、20、30、40、60 μmol/L)處理細(xì)胞24 h,對(duì)照組加入無水乙醇。在各孔細(xì)胞中加入胰酶做成細(xì)胞懸液后離心,將離心后的細(xì)胞加入200 μL緩沖液中重懸。后在此緩沖液中加入碘化丙啶(PI)及Annexin V-FITC各5 μL,置于暗處避光10 min后用流式細(xì)胞儀(Annexin V-PI法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。其中Annexin-V染色陽性且PI染色陰性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率為凋亡細(xì)胞所占的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴酸對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的石榴酸處理T24細(xì)胞24 h(α-亞麻酸作對(duì)照),各組膀胱癌細(xì)胞在570 nm的吸光值明顯降低,結(jié)果見圖1。由圖1可以明顯地看出,當(dāng)石榴酸的濃度較低(10 μmol/L)時(shí),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對(duì)活力并未出現(xiàn)明顯的變化。當(dāng)石榴酸的濃度為30 μmol/L時(shí),細(xì)胞的相對(duì)活力明顯下降,約為50%,而相同濃度的石榴酸與α-亞麻酸相比,前者對(duì)細(xì)胞活力的影響作用明顯強(qiáng)于后者,且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性,這可能與石榴酸具有的共軛三烯結(jié)構(gòu)有關(guān)。由此可以看出,石榴酸對(duì)T24細(xì)胞的增殖有抑制作用,且石榴酸對(duì)T24細(xì)胞的IC50為30 μmol/L,這種抑制作用明顯強(qiáng)于α-亞麻酸(*P<0.05)。

圖1 石榴酸對(duì)T24細(xì)胞活動(dòng)的影響

2.2 熒光顯微鏡檢測(cè)石榴酸對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響

在MTT法檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上,用不同濃度的石榴酸(0、30、60 μmol/L)處理T24細(xì)胞,采用熒光顯微鏡觀察T24細(xì)胞形態(tài)的變化,對(duì)照組為不加石榴酸的處理組,結(jié)果見圖2。由圖2可以看出,加入石榴酸的實(shí)驗(yàn)組可以明顯觀察到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣整齊,表面均勻,熒光較弱；30 μmol/L 石榴酸處理48 h后,細(xì)胞核體積明顯變小、皺縮,呈現(xiàn)致密的顆粒塊狀強(qiáng)熒光,同時(shí)核膜凹陷,染色增強(qiáng)；當(dāng)石榴酸濃度為60 μmol/L時(shí),細(xì)胞凋亡更加顯著,凋亡程度也增強(qiáng)。從圖2可以得出,石榴酸在較低濃度(30 μmol/L)時(shí)就對(duì)T24細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的促凋亡作用,使細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生較明顯的改變。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)石榴酸對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響

用不同濃度的石榴酸(0、30、60 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后,T24細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,見圖3。由圖3可以明顯看出,在一定濃度范圍內(nèi),T24細(xì)胞凋亡比例隨石榴酸濃度的增加而增加,并呈劑量依賴性。30和60 μmol/L石榴酸分別處理24 h,T24細(xì)胞的凋亡率分別為49.4%和80.6%。

圖2 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)

圖3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

以α-亞麻酸為對(duì)照,考察了石榴酸對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡影響。MTT結(jié)果顯示,石榴酸與α-亞麻酸相比較,對(duì)T24細(xì)胞的抑制作用更加明顯。Hoechst染色實(shí)驗(yàn)證明,石榴酸能引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,這一改變是由細(xì)胞凋亡引起的。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,石榴酸與α-亞麻酸相比,對(duì)T24的凋亡作用更明顯。

綜上所述,石榴酸能抑制膀胱癌T24細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡。本研究為膀胱癌的治療提供了新的思路和材料,與目前抗癌類藥物和放療化療治療膀胱癌相比,天然產(chǎn)物石榴酸具有原料易提取、安全性高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),是功能性食品開發(fā)的新材料。

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