龐 文 靜, 王 紅 英, 錢 斯 日 古 楞, 劉 德 祎

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

磁性高分子微球是近年發(fā)展起來的一種新型磁性材料,是通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒋判詿o機(jī)粒子與有機(jī)高分子結(jié)合形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球[1]。磁性復(fù)合微球不僅具有普通高分子微球的眾多特性還具有磁響應(yīng)性,所以不僅能夠通過共聚及表面改性等方法賦予其表面功能基團(tuán),如—OH、—COOH、—CHO、—NH2等,還能在外加磁場的作用下具有導(dǎo)向功能[2]。目前,磁性微球已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分離工程、免疫診斷、靶向藥物、催化劑載體等諸多領(lǐng)域[3-4]。以其作為載體對各種物質(zhì)進(jìn)行固定,經(jīng)過磁性固定后的大分子物質(zhì)可以在磁場的引導(dǎo)下進(jìn)行分離純化,效果良好且操作簡便,而且微球可以重復(fù)利用。近幾年,科學(xué)家們正致力于研究一種可用于微生物分離的磁性載體[5],磁性微球作為固定化載體顯示出良好的研究前景。

本文提出了用表面羧基化的磁性微球固定化微生物細(xì)胞的方法。研究了菌/磁性微球相對質(zhì)量比、pH、溫度等條件對固定化菌產(chǎn)酶的相對酶活力的影響,確定了磁性固定化Aeromonossp.F3菌體的最佳反應(yīng)條件,并對磁性固定化Aeromonossp.F3的操作穩(wěn)定性做了研究,以期為磁性固定化菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

細(xì)菌Aeromonossp.F3是由本課題組在前期工作中篩選并鑒定的產(chǎn)蛋白酶的一種海洋微生物；FeCl3·6H2O,FeCl2·6H2O,油酸,KMnO4等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 Aeromonos sp.F3的培養(yǎng)

將-80 ℃保藏的菌種,室溫放置2 h后,接種于種子培養(yǎng)基中,置于搖床(30 ℃、160 r/min)中搖瓶培養(yǎng)8 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖0.3,酵母浸粉0.9,氯化鈉0.5。

1.3 磁性微球的制備

1.3.1 磁性微球的制備

將0.2 mol/L FeCl3·6H2O和0.125 mol/L FeCl2·6H2O分別溶解于40 mL的去離子水中,混合于250 mL的三口燒瓶中,置于40 ℃水浴鍋中,攪拌均勻后,流加18 mL濃氨水；1 min后,逐滴加入4.26 g油酸,繼續(xù)在70 ℃的水浴中快速攪拌1 h。反應(yīng)結(jié)束后,用酒精洗滌2次,除去多余的油酸,再用去離子水洗滌至中性保存。

1.3.2 磁性微球的羧基化改性

取20 mL上述制得的磁性微球懸浮液(40 mg/mL),加入150 mL的KMnO4溶液(20 mg/mL),冰浴條件下,在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中破碎20 min。將氧化破碎后的磁性微球置于三口燒瓶之中,高速攪拌5 h,用去離子水洗滌3次,得到羧基化的磁性微球。

1.4 Aeromonos sp.F3菌體的磁性固定化

取培養(yǎng)好的菌液,在4 000 r/min的條件下離心20 min后棄上清液；沉淀用去離子水離心洗滌2次,將離心后的菌體分散于去離子水中,得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的菌液。將3 mL菌液中加入1 mL羧基化的磁性微球,并在一定條件下進(jìn)行固定化。借助磁場分離后用去離子水洗滌,得到磁性固定化細(xì)胞。將該固定化細(xì)胞接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30 ℃、160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)8 h。取上清液,測其酶活。

1.5 菌體磁性固定化條件的優(yōu)化

1.5.1 菌/磁性微球的質(zhì)量比對固定化的影響

在菌/磁性微球質(zhì)量比分別為1.9、3.1、4、4.9、5.4、6.2的條件下,常溫中固定化1 h后,用去離子水洗滌固定化菌,在磁場下分離并注入新鮮的培養(yǎng)基,置于搖床(30 ℃、160 r/min)中搖瓶培養(yǎng)8 h,取上清液,測其酶活。通過測定發(fā)酵上清液中酶活的大小。考察菌體的磁性固定化效能。

1.5.2 pH對固定化的影響

在菌/磁性微球質(zhì)量比為3.1,pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下,常溫中固定化1 h后,用相對應(yīng)的pH緩沖溶液洗滌,在磁場下分離并注入新鮮的培養(yǎng)基,置于搖床(30 ℃、160 r/min) 中搖瓶培養(yǎng)8 h,取上清液,測其酶活。

1.5.3 反應(yīng)時間對固定化的影響

在菌/磁性微球相對質(zhì)量比為3.1、pH為8的條件下,常溫中分別固定化15、30、45、60、75、90 min。用去離子水洗滌固定化菌后,在磁場下分離并注入新鮮的培養(yǎng)基,置于搖床(30 ℃、160 r/min) 中搖瓶培養(yǎng)8 h,取上清液,測其酶活。

1.5.4 反應(yīng)溫度對固定化的影響

在菌/磁性微球相對質(zhì)量比為3.1、pH為8的條件下,分別于5 、15 、30 、45 、60 ℃下固定化0.5 h后,用去離子水洗滌固定化菌,在磁場下分離并注入新鮮的培養(yǎng)基,置于搖床(30 ℃、160 r/min) 中搖瓶培養(yǎng)8 h,取上清液,測其酶活。

1.6 固定化菌操作穩(wěn)定性的探究

最佳條件下(室溫下,菌/磁性微球相對質(zhì)量比為3.1,pH為8固定化0.5 h),在搖床(30 ℃、160 r/min)中對固定化菌進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),每8 h更換一次新鮮培養(yǎng)基。

1.7 酶活力的測定

采用福林酚法測定菌體產(chǎn)生的蛋白酶活力。其中以酪蛋白為水解底物、酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌/磁性微球的相對質(zhì)量比對固定化的影響

選擇其他條件一定,而菌/磁性微球的相對質(zhì)量比不同的條件下進(jìn)行固定化后,對固定化菌連續(xù)培養(yǎng),測得酶活。如圖1所示,隨著菌/磁性微

圖1 菌/磁性微球的相對質(zhì)量比對固定化的影響

球的相對質(zhì)量比增大,即固定化體系中菌體濃度增大而磁性微球濃度降低時,在相同的培養(yǎng)條件下,酶活力隨著質(zhì)量比的增大而增大,但質(zhì)量比達(dá)到3.1以上時,酶活力趨于平穩(wěn)。故確定最佳質(zhì)量比為3.1。

2.2 pH條件對固定化的影響

改變固定化反應(yīng)體系中的pH,對固定化菌進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),測得酶活。如圖2 所示,pH對細(xì)胞固定化效率的影響較大,當(dāng)pH為8時相對酶活力最大。因此確定最佳pH為8。

圖2 pH對固定化的影響

2.3 反應(yīng)時間對固定化的影響

當(dāng)固定化反應(yīng)時間不同時,對固定化菌進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),測得酶活。如圖3所示,固定化時間對細(xì)胞固定化影響較小,考慮到細(xì)胞活性的因素,確定最佳反應(yīng)時間0.5 h。

圖3 時間對固定化的影響

2.4 溫度對固定化的影響

改變固定化反應(yīng)溫度時,對固定化菌進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),測得酶活。如圖4所示,在不同溫度下固定化菌產(chǎn)酶的相對活性呈小幅波動,說明溫度對菌體和磁性微球相互作用的影響并不顯著,但對菌體

圖4 溫度對固定化的影響

細(xì)胞的活性會有一定的影響,為降低能源消耗,選擇溫度較低的25 ℃為最佳反應(yīng)時間。

2.5 固定化菌連續(xù)培養(yǎng)的相對酶活力

在最佳反應(yīng)條件下,連續(xù)重復(fù)利用固定化菌產(chǎn)酶,測發(fā)酵上清液的相對酶活大小。如圖5所示,磁性固定化菌體可以重復(fù)利用7次,其產(chǎn)生胞外酶的相對酶活力仍可保持在50%～60%。

圖5 固定化菌連續(xù)培養(yǎng)的相對酶活力

3 結(jié) 論

采用改性的磁性微球固定化Aeromonossp.F3菌,并對其固定化條件和操作穩(wěn)定性進(jìn)行研究,得到磁性微球固定化Aeromonossp.F3菌的最佳條件為:固定化時間0.5 h,菌/磁性微球的相對質(zhì)量比為3.1,pH為8,溫度為25 ℃；在最佳條件下,磁性固定化菌重復(fù)利用7次時其產(chǎn)生胞外酶的相對活力仍保持在50%～60%,實現(xiàn)了Aeromonossp.F3菌體細(xì)胞在磁場作用下的有效分離和重復(fù)利用。本研究為功能化的磁性微球固定化菌的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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