曲 晶, 尹 亞 輝, 安 文 濤, 田 中 樂, 蘇 洪 旭, 趙 長 新

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.中糧麥芽(大連)有限公司, 遼寧 大連 116200)

0 引 言

大麥作為啤酒的主要原料越來越受到人們的關(guān)注。大麥發(fā)芽過程的主要酶類除了淀粉酶和蛋白酶外,還有植酸酶、多酚氧化酶等。植酸酶能降解植酸生成肌醇和無機磷等分子[1-2]。植酸酶活力的高低會影響大麥發(fā)芽的酸環(huán)境和金屬離子的變化,進而影響其他酶的作用,從而影響麥芽品質(zhì)[3-4]。多酚氧化酶是麥芽中的一種氧化還原酶[5],對啤酒的色澤、泡沫、風(fēng)味和非生物穩(wěn)定性有很大影響[6-7]。

大麥的制麥工藝在不斷地探索研究中日益成熟,但大部分研究都是在常壓的條件下進行的[8-10],對于在制麥過程中施加壓力的探索鮮有報道。本實驗通過在制麥的浸麥階段施加不同的壓力條件來研究大麥發(fā)芽過程中酶活力的變化,以期研究壓力對大麥發(fā)芽的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大麥:加拿大大麥Metcalfe,中糧麥芽(大連)有限公司提供。

試劑:可溶性淀粉、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉、冰醋酸、鉬酸銨、亞硫酸鈉、對苯二酚、鄰苯二酚、植酸鈉、酪蛋白、碳酸鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、三氯乙酸等均為分析純。

1.2 實驗儀器

YQ-PJ-6B型自動糖化器,輕工業(yè)部西安輕機所光電公司；WFJ7200可見光分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司；ZPS-250H智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱,黑龍江東拓儀器制造有限公司；標(biāo)準(zhǔn)EBC麥芽粉碎機,德國制造；PB-10型pH計,德國賽多利斯。

1.3 實驗方法

1.3.1 麥芽的制備

采用間歇浸麥的方式,并在浸麥階段以常壓為參照,分別施加0.05、0.10、0.15 MPa 3組壓力。發(fā)芽溫度16 ℃。常壓和0.05 MPa培養(yǎng)至100 h到達發(fā)芽終點,0.10和0.15 MPa培養(yǎng)至124 h到達發(fā)芽終點。

1.3.2 酶液的制備

準(zhǔn)確稱取10.00 g麥芽,經(jīng)過粉碎后倒入糖化杯內(nèi),加pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL,去離子水90 mL,40 ℃糖化鍋內(nèi)水浴攪拌1 h。離心(4 000 r/min)15 min,制得的上清液用來測定酶活力。

1.3.3 酶活力的測定

α-淀粉酶和β-淀粉酶活力的測定方法詳見參考文獻[11]；植酸酶活力的測定方法詳見參考文獻[12]；蛋白酶活力的測定方法詳見參考文獻[13]；多酚氧化酶活力的測定方法詳見參考文獻[14-15]。

酶活力測定的取樣時間從浸麥開始,分別為6.5、18.5、24、28、52、76、100、124 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力對植酸酶活力影響

由圖1可知,大麥萌發(fā)過程中,植酸酶的活力有明顯的上升趨勢。常壓組和0.05 MPa組達到酶活力最大值的時間相同,且酶活力較高；而0.10 和0.15 MPa組推后24 h達到酶活力最大值,且最大酶活力相對較低。在發(fā)芽開始階段,0.05 MPa 組的植酸酶活力低于常壓組,但40 h左右開始,0.05 MPa組的植酸酶活力略高于常壓組,且升高速度較快。這可能是由于較低的壓力對植酸酶空間結(jié)構(gòu)影響不大,壓力撤除后酶活力恢復(fù)較快的緣故,而較大的壓力對植酸酶的空間結(jié)構(gòu)影響較大,恢復(fù)酶活力所用的時間較長,并且在整個過程中植酸酶活力的大小也受到明顯的影響。

綜上所述,壓力并沒有改變植酸酶酶活力的變化趨勢,但對酶活力的大小和酶活力升高的速度產(chǎn)生一定的影響。

圖1 大麥發(fā)芽過程中不同壓力下植酸酶活力的變化

Fig.1 Change of phytase activity in barley germination process under different pressures

植酸酶活力的高低對其他酶類的作用也產(chǎn)生重要的影響。植酸酶水解植酸過程中,釋放的金屬離子對其他酶的活力可能產(chǎn)生激活作用。例如釋放的Ca2+是穩(wěn)定α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的重要金屬離子,對α-淀粉酶的活力有激活作用。釋放的Mg2+和Ca2+是蛋白酶的激活劑。植酸酶水解過程中釋放的磷酸鹽具有很好的緩沖作用,調(diào)節(jié)發(fā)芽過程中的pH,進而對酶活力的作用環(huán)境產(chǎn)生影響。

2.2 壓力對α-淀粉酶活力的影響

由圖2可知,在大麥發(fā)芽過程的浸麥階段壓力對α-淀粉酶活力的影響很小。發(fā)芽4 h后,α-淀粉酶開始快速合成,28～52 h過程中,常壓的α-淀粉酶活力上升最快,52～76 h 0.05 MPa組上升最快,并在76 h略高于常壓組酶活力,0.15和0.10 MPa組酶活力低于前兩組,且0.15 MPa組相對較高。100～124 h,0.15和0.10 MPa組α-淀粉酶活力有明顯的提高。

圖2 大麥發(fā)芽過程中不同壓力下α-淀粉酶活力的變化

Fig.2 Change of α-amylase activity in barley germination process under different pressures

α-淀粉酶活力的變化與赤霉素含量的變化趨勢是一致的,并且植酸酶釋放的Ca2+對酶活力的提高也有幫助。這體現(xiàn)為52～76 h,0.05 MPa組的α-淀粉酶活力提高速度最快,且在76 h處酶活力略高于常壓組。100～124 h酶活力的提高主要是赤霉素含量在此階段有所提高的緣故。

2.3 壓力對蛋白酶活力的影響

由圖3可知,在發(fā)芽的開始階段,即24～40 h左右,常壓組和0.05 MPa組的蛋白酶活力均有顯著的上升,但常壓組的蛋白酶活力相對較高。在40～60 h階段,0.05 MPa組的酶活力上升速度超過常壓組,且酶活力最大值高于常壓組的蛋白酶活力。這一現(xiàn)象可能由于壓力對酶構(gòu)象影響以及構(gòu)象恢復(fù)有關(guān),同時也與植酸酶對Mg2+和Ca2+的釋放有關(guān)。

圖3 大麥發(fā)芽過程中不同壓力下蛋白酶活力的變化

Fig.3 Change of protease activity in barley germination process under different pressures

從整體來看,常壓組和0.05 MPa壓力組的蛋白酶活力變化趨勢相似,都是在52 h處蛋白酶活力達到最大值,且平均水平高于后兩組。而0.10 和0.15 MPa組的蛋白酶活力最大值出現(xiàn)在76 h處。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因一方面是赤霉素的影響,另一方面可能是由于較高的壓力對蛋白酶構(gòu)象產(chǎn)生的影響較大,因而影響了蛋白酶的活力,壓力被撤除后,受影響較大的實驗組的酶的構(gòu)象恢復(fù)相對較慢,因而酶恢復(fù)活力達到最大值的時間向后推遲。

2.4 壓力對β-淀粉酶活力的影響

由圖4可知,在未發(fā)芽以前,大麥中β-淀粉酶具有一定的活力。且在浸麥和發(fā)芽的開始階段,β-淀粉酶活力基本處于穩(wěn)定狀態(tài),在52 h處,常壓組和0.05 MPa壓力組的β-淀粉酶活力開始有顯著增加,并在76 h處達到酶活力的最大值；而0.10 MPa組和0.15 MPa組在76 h處酶活力才開始顯著增加,在100 h處酶活力達到最大值,并且0.10 MPa組的最大酶活力高于0.15 MPa組。

圖4 大麥發(fā)芽過程中不同壓力下β-淀粉酶活力的變化

Fig.4 Change of β-amylase activity in barley germination process under different pressures

這一現(xiàn)象可能是由于β-淀粉酶活力的提高依賴于蛋白酶水解二硫鍵釋放出游離態(tài)有活力的β-淀粉酶。因而β-淀粉酶活力顯著增加的時間滯后于蛋白酶活力增加的時間。而0.10 MPa組的蛋白酶活力在最大值處高于0.15 MPa組的蛋白酶活力,這可能是0.10 MPa組的游離態(tài)β-淀粉酶含量較0.15 MPa組高,因而表現(xiàn)出的酶活力較高。

從整個發(fā)芽過程看,4組實驗中β-淀粉酶活力的平均水平按從高到低的順序排列為:0.15 MPa組、0.10 MPa組、0.05 MPa組、常壓組。因此可以看出,較高的壓力有利于發(fā)芽過程中β-淀粉酶活力的提高。這可能是因為壓力的增加使β-淀粉酶外表面與水分子之前形成的氫鍵數(shù)量增加[16],而β-淀粉酶分子內(nèi)的氫鍵相應(yīng)減少,從而降低了β-淀粉酶肽鏈的剛性,因而提高了β-淀粉酶的活性的緣故。

2.5 壓力對多酚氧化酶活力的影響

由圖5可以看出,多酚氧化酶活力在大麥發(fā)芽過程中呈上升的趨勢。在發(fā)芽剛開始的階段,即24～28 h,除0.10 MPa組外,多酚氧化酶活力在其他組中的變化不明顯。從28 h開始,多酚氧化酶活力在各組中都上升較快,常壓組在52 h處多酚氧化酶活力達到最大值,并且與0.05 MPa組和0.15 MPa組在52 h處的酶活力大小相近。而其余各組的多酚氧化酶活力在76 h處又開始迅速上升,并且均在100 h處達到多酚氧化酶活力的最大值,且明顯高于常壓組的最大值水平。

從圖5可以得出,壓力的作用可以使麥芽中的多酚氧化酶活力得到提高。多酚氧化酶使多酚物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合后可以與蛋白質(zhì)形成沉淀,在啤酒后期的制造中被過濾除去,從而能夠提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。加壓能夠提高多酚氧化酶活力,對啤酒生產(chǎn)有利。

圖5 大麥發(fā)芽過程中不同壓力下多酚氧化酶活力的變化

Fig.5 Change of polyphenol oxidase activity in barley germination process under different pressures

3 結(jié) 論

本實驗通過在浸麥過程的浸水階段施加壓力,比較壓力組與常壓組酶活力的不同變化,進而研究壓力對大麥發(fā)芽過程主要酶活力的影響。

結(jié)果表明,浸麥過程中施加的壓力對大麥萌發(fā)過程的主要酶活力的影響主要體現(xiàn)在兩方面:一是對酶活力變化趨勢的影響。施加壓力,酶活力的整體變化趨勢基本不變,但在一定范圍內(nèi)壓力的提高,酶活力變化趨勢隨時間有向后推移的現(xiàn)象;二是不同壓力對同一時刻的酶活力的大小有顯著的影響。從整體水平來看,隨著壓力在一定范圍內(nèi)的提高,植酸酶、α-淀粉酶、蛋白酶活力有所降低,但β-淀粉酶和多酚氧化酶的活力有所提高。

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