劉 栓 栓, 孫 慶 元, 宮 宏 琨

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus Oberthur)越冬幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。蟲草素(cordycepin)是冬蟲夏草菌中的活性成分。蟲草素的結(jié)構(gòu)與腺苷非常相似,所以又稱為3′-脫氧腺苷,也是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素[1-2],具有抗腫瘤[3]、抗菌抗病毒[4]、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基[5]等多種藥理作用。最早由Cunningham[6]等于1951年在Cordycepsmilitaris Link原漿液中分離獲得,該物質(zhì)被證實為我國中藥冬蟲夏草的有效成分,是蟲草特有的功能成分。

目前從蛹蟲草中提取和純化蟲草素比較常見。對于蟲草素的提取一般采用微波提取[7]、超聲波提取[8]、回流[9]、索氏提取[10]、浸提等方法。蟲草素的檢測的方法也很多,例如高效液相色譜[11]、毛細管電泳[12]、紫外[13]等方法。然而,方法簡單、操作較易、成本低廉的蟲草素提取和測定方法報道不多,特別是關(guān)于超聲波細胞破碎提取方法條件的研究較少。因此,本試驗采用超聲波細胞破碎法進行提取,進行了蟲草素提取條件的分析和優(yōu)化,并通過紫外分光光度法分析測定蟲草素的含量。

1 試驗材料

1.1 原 料

無性型蟲草qsun-1菌株[14],采集自四川省阿壩藏族羌族自治州黑水縣,經(jīng)分離純化后冰箱4 ℃保存。

1.2 試 劑

蟲草素(高純試劑),中國藥品生物制品鑒定所；甲醇、無水乙醇,山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；717強堿性陰離子交換樹脂,國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

1%牛肉粉PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200(煮沸30 min,過濾取汁),葡萄糖20,牛肉粉10,維生素B10.1,KH2PO41,MgSO41,瓊脂 20,pH 6.0,用于菌種的活化。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,牛肉粉10,維生素B10.1,KH2PO41,MgSO41,瓊脂 20,pH 6.0,用于菌種的發(fā)酵。

2 方 法

2.1 培養(yǎng)方法

菌種活化:將接種后的PDA平板培養(yǎng)基18 ℃ 培養(yǎng)7 d。

種子液:蟲草菌株qsun-1接種在1%牛肉粉PDA液體培養(yǎng)基中,于18 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

菌種發(fā)酵培養(yǎng):在250 mL三角瓶中裝入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基,并將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于18 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d。

2.2 蟲草菌株樣品制備

取出在搖床培養(yǎng)好的蟲草qsun-1菌株發(fā)酵液。3 000 r/min離心10 min。棄去上清液,將剩下的固體蟲草菌絲體充分洗滌、抽濾,置于60 ℃烘箱烘干、粉碎,稱干重。

2.3 蟲草素提取的條件優(yōu)化

2.3.1 超聲波冰浴條件準備

在250 mL燒杯中裝入2/3的冰塊,在冰塊中挖出可放進50 mL燒杯的空間,然后蓋上泡沫環(huán),放入小燒杯[15]。

2.3.2 單因素試驗

精確稱取0.145 0 g蟲草菌絲體,于超聲波細胞粉碎機中按提取基本條件(400 W、5 s、5 s)破碎提取20 min,分別考察提取溶劑、超聲波功率、超聲波提取時間、料液比對蟲草素提取的影響。

其中要考察的試驗條件具體為提取溶劑:蒸餾水、甲醇、無水乙醇；超聲波功率:100、200、300、400、500、600 W；超聲波提取時間:10、15、20、25、30、35 min；料液比(g/mL):1∶100、1∶130、1∶160、1∶190、1∶220、1∶250。

2.3.3 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上,通過正交試驗進一步考察提取溶劑、超聲波功率、提取時間和料液比之間的相互影響,并確定超聲波細胞破碎提取冬蟲夏草菌絲體中蟲草素的最佳工藝參數(shù)。

2.4 分析檢測方法

2.4.1 紫外分光光度法檢測蟲草素含量

精密稱取5 mg蟲草素標準品,分別配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的蟲草素溶液,紫外分光光度法測量吸光度,并以吸光度(Y)對蟲草素的質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸,得蟲草素的回歸方程為:Y=0.061 23X+0.013 1,R=0.997 9。

2.4.2 蟲草素提取量的計算

蟲草素提取量=蟲草素質(zhì)量濃度×稀釋體積/冬蟲夏草菌絲體質(zhì)量。

2.5 樣品純化

將超聲波細胞破碎提取法最佳工藝提取的樣液,分別量取1、2、3 mL各3份,同樣條件下9份樣液分別經(jīng)717強堿性陰離子樹脂純化,紫外分光光度法檢測蟲草素提取量,計算蟲草素純化洗脫得率和純度。

3 結(jié)果與分析

3.1 冬蟲夏草蟲草素的定性檢測

將提取樣在紫外分光光度計100～500 nm波長范圍內(nèi)掃描,結(jié)果如圖1所示。

圖1 蟲草素紫外光譜掃描曲線

由圖1可知,樣品在259 nm處有最大吸收峰,蟲草素吸收光譜在259 nm[16],可判定樣品中含有蟲草素。

3.2 蟲草素提取條件的確定優(yōu)化

3.2.1 提取溶劑對蟲草素提取量的影響

以蒸餾水、甲醇和無水乙醇作為提取溶劑進行提取蟲草素,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑對蟲草素提取量的影響

由圖2可以看出,以甲醇作溶劑提取蟲草素的效果最佳,分別比以蒸餾水和無水乙醇作溶劑時蟲草素提取率高8.15%和29.18%。蒸餾水作溶劑也比無水乙醇作溶劑提取蟲草素的效果好。因此,選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2.2 超聲波功率對蟲草素提取量的影響

采用甲醇為提取溶劑,超聲波提取時間為20 min,結(jié)果如圖3所示。在超聲波功率較小時,隨著超聲波功率的增加,蟲草素提取量也不斷增加,在超聲波功率達到400 W之后,蟲草素提取量開始減少,超聲波功率到達600 W時,蟲草素提取量比功率100 W時的還少。

圖3 超聲波功率對蟲草素提取量的影響

原因可能是在超聲波功率適當時,超聲波可在液體中產(chǎn)生“空穴作用”,而“空穴作用”產(chǎn)生的沖擊波和射流可以破壞細胞和細胞膜結(jié)構(gòu),從而增加細胞內(nèi)容物通過細胞的穿透能力,有助于蟲草素的釋放和溶出,超聲波使提取液不斷振蕩,有助于溶質(zhì)擴散[17]。當超聲波功率過大時,產(chǎn)熱更快,導(dǎo)致分子的裂解,使部分蟲草素有所損失。凌建亞等[12]也認為物質(zhì)的加熱程度和細胞的破碎程度與超聲波的功率有關(guān)。因此,選擇功率為400 W的超聲波。

3.2.3 提取時間對蟲草素提取量的影響

采用甲醇為提取溶劑,超聲波功率400 W,考察了不同的超聲波提取時間對蟲草素提取的影響,結(jié)果如圖4所示。隨著超聲波提取時間的增加,蟲草素提取量也增加,當達到20 min時,蟲草素提取量達到最高,每克菌絲體可提取8.459 mg蟲草素。然后,隨著超聲波提取時間繼續(xù)增加,蟲草素提取量卻不斷下降。

圖4 超聲波提取時間對蟲草素提取量的影響

原因可能是在超聲波提取時間適當時,超聲波的熱效應(yīng)使水溫對原料有水浴作用[17],但隨著提取時間的持續(xù)增加,熱量積累越來越多,破壞了部分蟲草素。因此,選擇超聲波提取時間為20 min。

3.2.4 料液比對蟲草素提取量的影響

在以甲醇作為提取溶劑、超聲波功率400 W、提取時間20 min的條件下,分別采用不同的料液比對蟲草素進行提取,結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出,隨著料液比的增加,蟲草素提取量也增加,當料液比達到1∶130時,蟲草素的提取量達到最大,每克菌絲體可提取8.568 mg蟲草素。當料液比超過1∶130時,隨著料液比的增加,蟲草素的提取量逐漸減少,當料液比增加到1∶220,蟲草素的提取量有所增加,但是仍低于1∶130 時蟲草素的提取量,然后隨著料液比的繼續(xù)增加蟲草素提取量呈減少的趨勢。因此,選擇料液比為1∶130。

圖5 料液比對菌絲體中蟲草素提取量的影響

3.2.5 超聲波細胞破碎提取蟲草素不同條件的正交分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇不同的提取溶劑(A)、超聲波功率(B)、提取時間(C)和料液比(D)為影響因素,選用L9(34)正交表進行試驗,正交試驗因素水平表見表1,試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 超聲波細胞破碎提取工藝L9(34)正交試驗結(jié)果分析

Tab.2 Analysis of the L9(34) orthogonal experiments for extraction process of ultrasonic cell disruption

試驗組 A B C D蟲草素提取量/(mg?g-1)111118.568212226.456313337.874421235.238522329.112623117.841731327.186832234.818933117.370Ⅰj22.89820.99221.22725.050t=64.463Ⅱj22.19120.38619.06421.483Ⅲj19.37423.08524.17217.930極差R j3.5242.6995.1087.120主次順序D>C>A>B最優(yōu)方案A1-B3-C3-D1

如表2所示,各因素對蟲草素提取量的影響次序是D>C>A>B,即料液比最為重要,其次為提取蟲草素的溶劑,再次為超聲波功率,最后是提取時間。其最優(yōu)方案為A1-B3-C3-D1,即最優(yōu)提取工藝是冬蟲夏草菌絲體在料液比為1∶100、提取溶劑為甲醇、超聲波功率為300 W的條件下進行細胞破碎,并提取30 min時可提取的蟲草素量最大。

3.2.6 最佳工藝條件的驗證

由于最佳組合A1-B3-C3-D1不在正交試驗設(shè)計中,且正交試驗設(shè)計范圍沒出現(xiàn)峰值,應(yīng)擴大試驗范圍進一步設(shè)計試驗。按照正交試驗優(yōu)選工藝A1-B3-C3-D1和試驗設(shè)計中的較優(yōu)組合A2-B2-C3-D2,進行驗證對比試驗,結(jié)果見表3。

表3 超聲波細胞破碎提取優(yōu)選工藝驗證

由表3可以看出,正交試驗優(yōu)選工藝A1-B3-C3-D1的蟲草素提取量為9.275 mg/g,而A2-B2-C3-D2工藝的蟲草素提取量為9.112 mg/g。通過差異顯著性分析,兩種提取工藝在α=0.05水平下有顯著性差異。因此,可以確定最優(yōu)工藝為A1-B3-C3-D1,即提取料液比為1∶100、溶劑為甲醇、超聲波功率為300 W、提取時間為30 min,蟲草素提取量最大。

3.3 離子交換法純化蟲草素

用717強堿性陰離子交換樹脂純化冬蟲夏草菌絲體中的蟲草素提取液,用蒸餾水作為洗脫試劑,結(jié)果如表4所示。

表4 717強堿性陰離子交換樹脂純化提取液樣品洗脫得率和純度

Tab.4 Elution rate and purity for extract sample using 717 strong-based anion exchange resin

純化前樣品提取量/μg純化后樣品提取量/μg保留率/%純度/(mg?L-1)17.37614.20081.7214.20034.75227.96780.4713.98452.12841.72980.0513.910

由表4可以看出,蟲草素的洗脫率為80.05%～81.44%,平均值為80.75%,蟲草素的質(zhì)量濃度為13.910～14.200 mg/L,平均值為14.031 mg/L。純化后的樣品紫外全波段掃描圖雜質(zhì)峰減少,蟲草素的保留率也較高。因此,用717強堿性陰離子交換樹脂純化蟲草素提取液是一種可靠有效的純化手段。

4 結(jié) 論

通過單因素試驗和正交試驗得出超聲波細胞破碎提取蟲草素的最佳工藝條件:提取溶劑為甲醇、超聲波功率為300 W、超聲波全程作用時間為30 min、料液比(g/mL)為1∶100。超聲波細胞破碎提取方法在中藥有效成分提取、分離和制備工藝中的應(yīng)用,可以大大縮短提取時間,且低溫提取有利于保護有效成分,是一種操作簡便,受外界干擾因素限制少的蟲草素提取方法。通過717強堿性陰離子交換樹脂純化蟲草素提取液,紫外全波段掃描圖雜質(zhì)峰減少,蟲草素保留率比較高,是一種可靠有效的蟲草素純化方法。

測定無性型冬蟲夏草qsun-1子實體中蟲草素的含量較高,表明該冬蟲夏草菌株的品質(zhì)優(yōu)良,具有較好的開發(fā)利用價值。

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