劉 飛, 王 東 明, 劉 春 瑩, 左 佳 敏, 張 玉 蒼, 金 鳳 燮

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.百威英博(四川)啤酒有限公司, 四川 資陽(yáng) 641300; 3.海南大學(xué) 材化學(xué)院, 海南 ?？?570228)

0 引 言

人參皂苷大多為三萜類(lèi)皂苷,廣泛存在于人參屬植物的根、莖、葉中,是藥材中主要的藥物活性成分之一,在疾病預(yù)防及治療方面,具有抗衰老[1]、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力[2-3]、保護(hù)神經(jīng)[4]、抗腫瘤[5]等療效。迄今為止,為人們所熟知的人參皂苷就多達(dá)60多種,且各種人參皂苷所發(fā)揮的藥理作用與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有著密不可分的關(guān)系。為了對(duì)皂苷有著更加深入地了解,制備純凈的單體人參皂苷顯得尤為重要。人參皂苷Rg2(組)包含4種異構(gòu)體,分別是20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4(如圖1所示)。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,性質(zhì)相近,給分離純化帶來(lái)了一定的難度。YANG[6]通過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化人參皂苷Rg2,得到了純度為70%左右的混合物。楊博[7]應(yīng)用重結(jié)晶法拆分了20(S)-Rg2及20(R)-Rg2,結(jié)果僅得到95.3%的20(S)-Rg2。郭偉芳等[8]采用高效液相色譜法對(duì)20(S)-Rg2 及20(R)-Rg2兩種人參皂苷進(jìn)行了分離研究,雖取得顯著效果,但是不夠全面。目前,系統(tǒng)地對(duì)人參皂苷Rg2(組)所包含的4種皂苷進(jìn)行分離純化方面研究的文章,未見(jiàn)發(fā)表。

本論文嘗試采用制備色譜技術(shù)對(duì)人參皂苷Rg2(組)的4種單體進(jìn)行了分離研究,為少量制備單體人參皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4提供了依據(jù)。

注:Glc,β-D-吡喃葡萄糖基；Rha,α-L-吡喃鼠李糖基

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與材料

薄層層析板Silica Gel 60-F254,德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀；日本Jasco高效液相色譜儀；Jasco-UV1575紫外檢測(cè)器,LC-NetⅡ色譜工作站,SinoChrom ODS-BP高純硅膠色譜柱(5 μm,φ10 mm×250 mm)；Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司；Kromasil C18色譜柱(5 μm,φ4.6 mm×250 mm)。甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?美國(guó)TEDIA公司；人參皂苷Rg2(組),本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 薄層層析法(TLC)

采用薄層層析法檢測(cè)人參皂苷Rg2(組)。微量點(diǎn)樣器吸取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品及樣品,等間距、均勻地點(diǎn)樣于薄層層析板上。根據(jù)樣品濃度適量增減點(diǎn)樣量,每次點(diǎn)樣前,均需風(fēng)干上一次所點(diǎn)樣品。展開(kāi)劑選用體積比為7∶2.5∶0.5的氯仿-甲醇-水溶液的澄清下層溶液。顯色劑為10%硫酸溶液,加熱顯色。

1.2.2 色譜條件

制備色譜:色譜柱為SinoChrom ODS-BP(5 μm,φ10 mm×250 mm),流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)。0～180 min,31%A等度,180～300 min, 43%A等度,體積流量為0.8 mL/min,樣品質(zhì)量濃度為100 mg/mL,進(jìn)樣量為500 μL,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

分析色譜:色譜柱為Kromasil C18(5 μm,φ4.6 mm×250 mm),體積流量為1 mL/min,樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫為35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)所用流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)(0～20 min,20%A等度；20～31 min,20%～32%的A線(xiàn)性梯度；31～40 min,32%～43%的A線(xiàn)性梯度；40～70 min,43%～100%的A線(xiàn)性梯度),對(duì)分離產(chǎn)品檢測(cè)所用流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)(20(S)-Rg2、20(R)-Rg2,31%A等度；Rg6、Rg4,43%A等度)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品檢測(cè)

首先對(duì)待分離樣品采用TLC法檢測(cè)。由圖2可知,本次實(shí)驗(yàn)所用人參皂苷Rg2(組)樣品純度極高,幾乎僅含有20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4等4種人參皂苷,因此,可作為制備4種皂苷的原料。

1,人參皂苷Rg6、Rg4標(biāo)準(zhǔn)品；2,人參皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2標(biāo)準(zhǔn)品；3,人參皂苷Rg2(組)樣品

圖2 人參皂苷Rg2(組)TLC圖譜

Fig.2 TLC results of ginsenoside Rg2 (group)

2.2 Rg2(組)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

按照“1.2.2”中所述色譜條件,對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,人參皂苷20(S)-Rg2 吸收峰先于20(R)-Rg2出現(xiàn),且由出峰時(shí)間推測(cè)可知,此時(shí)的洗脫劑體積分?jǐn)?shù)約為31%的乙腈溶液；人參皂苷Rg6吸收峰先于Rg4出現(xiàn),且此時(shí)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)約為43%的乙腈溶液。由于4種組分在HPLC圖上呈現(xiàn)出4個(gè)峰,因此可以采用此方法對(duì)4種組分進(jìn)行分離。

圖3 人參皂苷Rg2(組)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

2.3 制備型HPLC分離Rg2(組)皂苷

根據(jù)“2.2”的結(jié)論,人參皂苷Rg2(組)樣品采用制備型HPLC進(jìn)行少量制備。50 mg樣品先后經(jīng)31%及43%乙腈溶液等度洗脫分離,收集不同峰對(duì)應(yīng)的洗脫液,混合、干燥,分別獲得20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4等4種皂苷2.6、2.8、1.5及3.9 mg。然后采用HPLC對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行純度檢測(cè),結(jié)果如圖4所示,各分離產(chǎn)物在HPLC圖譜中幾乎都為單峰,經(jīng)峰面積換算后得到各種皂苷純度分別為:20(S)-Rg2皂苷的純度為95.3%,20(R)-Rg2皂苷的純度為96.4%,Rg6皂苷的純度為96.3%,Rg4皂苷的純度為98.3%,達(dá)到了分離純化的效果。

(a) 20(S)-Rg2

(b) 20(R)-Rg2

(c) Rg6

(d) Rg4

圖4 分離皂苷HPLC圖譜

Fig.4 The ginsenosides separated on HPLC

3 結(jié) 論

綜上所述,通過(guò)制備色譜技術(shù)可以對(duì)人參皂苷Rg2(組)4種組分進(jìn)行有效地分離,且純度較高。因此,制備色譜技術(shù)可應(yīng)用于20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4 4種皂苷的制備,但是,Rg6及Rg4不穩(wěn)定,互相轉(zhuǎn)化,有待于研究其保存方法。

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