王 漫，穆立薔*，周智博，姜 鶴

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

沙棗（Elaeagnus angustifoliaL.），系胡頹子科（Elaeagnaceae）胡頹子屬（Elaeagnus）落葉喬木，主要分布于我國東北、西北等地區(qū)，具有抗旱、抗鹽堿、耐貧瘠、防風(fēng)固沙的特性[1]，是集生態(tài)效益與經(jīng)濟(jì)效益于一體的資源植物。沙棗的枝皮、果實(shí)、葉片和花粉中都含有總黃酮，總黃酮是植物在代謝過程中產(chǎn)生的一類天然化合物[2-3]，其結(jié)構(gòu)類型多樣，生物活性廣泛，無論在食品還是醫(yī)藥領(lǐng)域都具有廣闊的開發(fā)利用前景。研究表明，沙棗總黃酮具有降低血清膽固醇、抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、清除羥基自由基、治療慢性氣管炎、冠心病等功效[4-7]。目前，關(guān)于沙棗葉總黃酮的研究多集中于提取工藝優(yōu)化方面，尚未見其前處理方式的相關(guān)報道。其實(shí)驗以超聲波法提取總黃酮，紫外-可見分光光度法測定其含量，研究了干燥方法、烘干溫度、破碎度對其總黃酮得率的影響，比較了各生長期總黃酮含量差異，為沙棗資源更有效合理地開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，同時為其工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棗葉：采摘于黑龍江省肇東市，黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院宋富強(qiáng)教授提供。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、石油醚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；KQ3200超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝儀器公司；721分光光度計：天津泰斯特儀器公司；FJ-200高速萬能粉碎機(jī)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試沙棗葉片含水量測定[8]

取采摘的新鮮沙棗葉片200g，平鋪于干燥鋁盤中，厚度不超過20mm，于105℃干燥5h，迅速將鋁盤移置干燥器中冷卻30min，精確稱其質(zhì)量。以上沙棗葉樣品再干燥1h后冷卻，稱其質(zhì)量，至兩次連續(xù)稱質(zhì)量差異小于1g；重復(fù)測定3次，取平均值，沙棗葉含水量計算公式如下：

式中：W1為鋁盤質(zhì)量，g；W2為鋁盤與新鮮沙棗葉質(zhì)量，g；W3為鋁盤與烘干沙棗葉質(zhì)量，g。

1.3.2 沙棗葉前處理工藝

①干燥方法

取同一批次采摘沙棗鮮葉每份100g，以不同干燥方式進(jìn)行干燥（干燥程度均達(dá)到葉片質(zhì)硬而脆，相互之間質(zhì)量差異小于1g），記錄干燥時間，具體干燥方法見表1。

表1 沙棗葉不同干燥方法Table 1 Different drying methods ofElaeagnus angustifoliaL.leaves

②破碎程度

取80℃條件下烘干沙棗葉，粉碎處理，分別過40目、60目、80目、100目和120目篩備用，采用超聲波法進(jìn)行總黃酮的提取，分析其得率變化。

③生長期

黑龍江省物候期稍遲，選定2012年5月至9月此段生長期，于每月第15日對標(biāo)記的沙棗樹進(jìn)行葉片采摘，以最佳前處理方式處理后測定各生長期總黃酮含量，選定葉片最佳采摘時期。

1.3.3 脫脂、除雜

經(jīng)干燥、粉碎后的沙棗葉樣品，按1∶10（w/v）比例加入60℃～90℃沸程的石油醚，置于40℃水浴恒溫?fù)u床中以100r/min振蕩浸提2h，抽濾，重復(fù)3次，除去油脂、色素等雜質(zhì)，揮干石油醚備用。

1.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精確稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.6mg于100mL容量瓶中，加入70%vol乙醇進(jìn)行溶解并定容配制成質(zhì)量濃度為0.206mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL和3.0mL分別置于7支10mL具塞試管中（按順序分別以0，1…6號進(jìn)行編號），補(bǔ)充70%vol乙醇至5mL，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaNO2溶液0.3mL，混勻，放置6min后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Al（NO3）3溶液0.3mL，混勻，6min后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%NaOH溶液4mL，混勻，用70%vol乙醇標(biāo)定至刻度線，放15min，設(shè)0號管為空白對照，于510nm波長處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=11.429x+0.0037（y為吸光度值，x為蘆丁質(zhì)量濃度，R2=0.9999）。

1.3.5 沙棗葉總黃酮超聲波提取法及含量測定[9-12]

稱取備用沙棗葉樣品1.00g置于錐形瓶中，在75%vol乙醇為提取液、料液比為1∶25、超聲功率為300W，溫度為45℃條件下超聲波提取30min，抽濾，重復(fù)進(jìn)行提取3次，合并提取液并真空濃縮，干燥后得沙棗葉總黃酮提取物。

精確量取沙棗葉75%vol乙醇提取液1.0mL，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，按照1.3.5項標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法加NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系顯色，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量，做3次平行實(shí)驗?？傸S酮含量計算公式如下：

式中：C為根據(jù)回歸方程計算得到總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為所用原料葉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮沙棗葉片含水量測定

新鮮沙棗葉含水量平行測定3次，得摘取沙棗葉的平均含水量為64.85%。

2.2 干燥方法對沙棗葉總黃酮得率影響

將新鮮沙棗葉按照1.3.2項干燥方法進(jìn)行處理，粉碎過40目篩，以1.3.5項超聲波法進(jìn)行提取，記錄干燥時間，比較總黃酮得率，結(jié)果分別見圖1、圖2。

圖1 不同干燥方法對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of different drying method on the yield of total flavonoids

由圖1、圖2可知，5種干燥處理從總黃酮得率角度比較，優(yōu)選順序為：凍干＞90℃烘干＞陰干＞50℃烘干＞曬干。從干燥時間角度比較，優(yōu)選順序為：90℃烘干＞凍干＞50℃烘干＞曬干＞陰干。綜合總黃酮得率與干燥耗時分析，實(shí)驗中凍干處理總黃酮得率最高，達(dá)到1.62%，干燥時間較短4h，但設(shè)備昂貴，能耗大，生產(chǎn)能力有限；其次是90℃烘干處理，得率為1.39%，干燥時間最短為1.2h，且更利于生產(chǎn)實(shí)踐。陰干處理耗時最長，曬干處理后總黃酮得率最低，為1.18%，且耗時較長為34h，因此采摘沙棗葉時應(yīng)避免使用曬干法。

圖2 不同干燥方法與時間關(guān)系Fig.2 The relationship between drying method and drying time

2.3 烘干溫度對沙棗葉總黃酮得率影響

將鮮葉分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，記錄烘干時間，粉碎過40目篩，比較沙棗葉總黃酮得率，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 不同烘干溫度對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of different drying temperature on the yield of total flavonoids

圖4 不同烘干溫度與時間的關(guān)系Fig.4 The relationship between drying temperature and drying time

生產(chǎn)實(shí)踐中烘干法為最適干燥方法，由圖3、圖4表明，隨著烘干溫度升高，烘干時間不斷縮短，沙棗葉總黃酮得率也隨之出現(xiàn)變化。在50℃～80℃范圍內(nèi)隨著烘干溫度升高，總黃酮得率不斷升高，當(dāng)烘干溫度為80℃時，得率達(dá)到最高，為1.51%，烘干時間相對較短為2.5h；當(dāng)溫度超過80℃后，隨著烘干溫度的升高，總黃酮得率逐漸降低，100℃時總黃酮得率，為1.17%，相對于80℃時下降了22.5%。當(dāng)烘干過程中溫度超過100℃時，葉片需及時翻動，否則極易焦化。

2.4 破碎程度對沙棗葉總黃酮得率影響

按照1.3.2項破碎程度處理方式對沙棗葉處理，進(jìn)行總黃酮的提取，比較總黃酮得率，結(jié)果見圖5。

圖5 不同粒度對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of different grind degrees on the yield of total flavonoids

沙棗葉樣品粒度不同，總黃酮得率也不同，由圖5可知，粒度從40目到60目時隨破碎程度增加，總黃酮得率有所增加。沙棗葉樣品粒度60目時總黃酮得率達(dá)到最大1.57%；但破碎度超過60目后，沙棗葉總黃酮得率逐漸減少，沙棗葉樣品粒度120目時，總黃酮得率僅為1.29%，下降了17.8%?？赡芤驗樯硹椚~粉末過細(xì)，固液分離的難度增大，損失增加，所以實(shí)際操作中選擇粒度60目為宜。

綜上所述，沙棗葉提取總黃酮凍干法得率最高，其次為烘干法（最適于生產(chǎn)實(shí)踐），50℃～100℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為80℃，最佳破碎度為粉碎過60目篩。

2.5 不同生長期沙棗葉中總黃酮含量變化

按照1.3.2項選擇生長期采摘沙棗葉片，80℃烘干后粉碎過60目篩，按照1.3.5項方法測定總黃酮含量，結(jié)果見圖6所示。

圖6 不同生長期對總黃酮含量的影響Fig.6 Effects of different growth periods on the yield of total flavonoids

黑龍江地區(qū)物候期稍遲，實(shí)驗選定生長期為5月～9月。由圖6可知，總黃酮含量優(yōu)選順序為，9月＞8月＞6月＞7月＞5月，9月份沙棗葉總黃酮含量最高，達(dá)到1.78%，在黑龍江省9月沙棗進(jìn)入生長后期，經(jīng)過一個生長季的發(fā)育生長，一些次生代謝產(chǎn)物有了較多的積累，且沙棗此時已成熟，采摘沙棗葉片不會影響沙棗植株生長及沙棗收獲。

3 討論

3.1 不同干燥方法對沙棗葉總黃酮得率影響

植物鮮樣提取有效成分不易保存并且受季節(jié)條件限制，干燥處理成為必要工藝。不同的干燥方法對沙棗葉中總黃酮得率有較大影響，實(shí)驗中冷凍干燥后總黃酮得率最高，處理時間較短，但設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，生產(chǎn)能力有限；曬干處理后總黃酮得率最低，可能是由于沙棗葉總黃酮中部分物質(zhì)對光不穩(wěn)定，在太陽光照射下易發(fā)生氧化，從而使樣品中總黃酮得率下降。陰干與曬干處理易受天氣影響，并需要很長時間和較大場地，在生產(chǎn)中不好實(shí)現(xiàn)。相比而言，烘干處理得率高，所需時間短，更便于實(shí)際應(yīng)用。實(shí)驗得出，80℃為最佳烘干溫度，總黃酮得率達(dá)到1.51%，烘干時間相對較短2.5h。說明沙棗葉提取的總黃酮耐熱性較穩(wěn)定，只有部分成分在烘干溫度過高（超過80℃）時會發(fā)生分解[13]，因而生產(chǎn)實(shí)踐中選擇最適干燥方式為80℃條件下烘干。

3.2 不同破碎程度對沙棗葉總黃酮得率影響

沙棗葉破碎程度對總黃酮得率的影響較大，沙棗葉總黃酮提取時樣品粒度選擇60目為宜。通過破碎可以在減少擴(kuò)散微粒的半徑同時增大擴(kuò)散面積，傳質(zhì)作用面積增大，得率增加[14]，即一定范圍內(nèi)，隨著破碎度的增加，得率提高。而當(dāng)樣品過于粉碎，粉末目數(shù)達(dá)一定程度時，固液分離的難度加大，過濾時濾餅中殘留的濾液量增多，損失加大，使得率反而下降，且粉末過細(xì)，浸提出的雜質(zhì)和副產(chǎn)物越多，不利于純化。

3.3 不同生長期對沙棗葉總黃酮含量影響

總黃酮是植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累與植物的生長發(fā)育程度及外界環(huán)境因素密切相關(guān)[15]。從實(shí)驗結(jié)果可知，沙棗葉中的總黃酮含量9月份最高；從生理情況看，黑龍江省物候期稍遲，5月份沙棗處于發(fā)芽、幼葉生長時期，需要消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，致使總黃酮含量大幅度下降；6、7月份主要處于開花、結(jié)果時期，葉片總黃酮含量相對較低，不宜采摘；8月份早熟沙棗果已趨成型，葉中總黃酮含量明顯升高。9月份黑龍江省已進(jìn)入沙棗植株生長后期，經(jīng)過一個生長季的發(fā)育生長，一些次生代謝產(chǎn)物有了較多的積累，這可能是沙棗中總黃酮類含量9月份要高于其他月份的原因。因此，選定9月開始逐步采摘沙棗葉，既有利于沙棗植株生長，又有利于其總黃酮的提取。

4 結(jié)論

不同前處理方式對沙棗葉總黃酮提取有較大影響。實(shí)驗結(jié)果表明，凍干法干燥后提取沙棗葉總黃酮得率最高，達(dá)到1.62%；其次為烘干法，最佳烘干溫度為80℃，最佳破碎度為60目，此條件下總黃酮得率為1.57%，且烘干法更便于實(shí)際應(yīng)用；生長期間，9月摘取沙棗葉最為適宜，沙棗葉總黃酮含量為1.78%。

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