袁雪芬，張智海，朱 凱*

（南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

肉香味形成的主要前體物包括2大類：水溶性物質(zhì)和脂質(zhì)[1]。水溶性物質(zhì)主要形成肉類的一般性風(fēng)味，而脂質(zhì)則是形成不同肉類特征性風(fēng)味的主要物質(zhì)。很多研究表明[2-4]，在肉類烹調(diào)過程中，是由美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化降解反應(yīng)及兩者之間的相互作用反應(yīng)共同形成了濃郁的肉香味。

早前，關(guān)于還原糖和氨基酸反應(yīng)直接制備肉味香料的研究很多[5-6]，關(guān)于植物油脂氧化制備香味料的報道也較多[7]，而關(guān)于脂肪氧化降解對肉味香料的貢獻(xiàn)的研究卻相對較少。脂質(zhì)在氧化過程中，不飽和脂肪酸與氧發(fā)生自由基鏈反應(yīng)生成氫過氧化物，氫過氧化物雖無色無味，但進(jìn)一步降解可形成醛類、酮類等具有芳香性氣味的小分子物質(zhì)，并且可與美拉德反應(yīng)相互作用，改變其反應(yīng)途徑，產(chǎn)生一些特征性香味物質(zhì)[8-9]。普通的脂肪氧化途徑有兩種：自氧化和加熱氧化。自氧化一般是酸敗的表現(xiàn)，而加熱氧化需要的溫度相對較高。研究發(fā)現(xiàn)，大豆等植物中存在的脂肪氧合酶能專一催化含有cis，cis-1，4戊二烯結(jié)構(gòu)的直鏈脂肪酸、脂肪酸酯和醇，通過分子內(nèi)加氧反應(yīng)形成含有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物[10-12]。以酶催化脂肪氧化，不僅反應(yīng)條件溫和且反應(yīng)過程綠色無污染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞脂：南京華揚(yáng)香精香料實(shí)業(yè)有限公司；大豆：市場購買；亞油酸：阿拉丁試劑公司；石油醚：無錫市亞盛化工有限公司；碘化鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異辛烷：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；硫代硫酸鈉：上海久億化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHJF-4002型低溫恒溫反應(yīng)攪拌?。亨嵵菔锌乒べQ(mào)有限公司；XDW600XZ-65L無油空氣壓縮機(jī)：浙江省磐安工業(yè)園區(qū)；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪氧合酶提取[13-14]

將大豆粉碎后40目過篩，經(jīng)石油醚（沸程60℃～90℃）浸提2h，得脫脂豆粉。每批次取20g脫脂大豆粉，加入200mL蒸餾水，室溫條件下攪拌浸提1h，再由離心機(jī)在常溫5000r/min條件下離心25min，得脂肪氧合酶粗酶液。

1.3.2 雞脂氧化方法測定[15]

在裝有電動攪拌器、溫度計、導(dǎo)氣管及回流冷凝管的四口燒瓶中加入一定量的雞脂、硼酸鹽緩沖液及脂肪氧合酶粗酶液，通入壓縮空氣，反應(yīng)一定時間后，取上層雞脂，測定其過氧化值。

1.3.3 酶活測定方法[13，16]

酶活定義：在25℃，pH值為9.0，以亞油酸為反應(yīng)底物，以1min內(nèi)3mL反應(yīng)體系在波長234nm處的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位。

底物配制：在10mLpH值為9的硼酸鹽緩沖液（0.2mol/L）中，加入0.25mL吐溫-20，混合均勻，再逐滴加入0.27mL亞油酸，充分混合。加入1mol/L氫氧化鈉溶液使體系澄清，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至9，然后將該溶液稀釋至500mL。

分光光度法測定吸光度：取0.2mL粗酶液（已稀釋一定倍數(shù)）移入25℃，1.5mL的底物溶液中，混合均勻后于25℃的恒溫水浴中保溫3min。用5mL無水乙醇終止反應(yīng)，加入5mL蒸餾水，混合均勻后于波長234nm處測定反應(yīng)液吸光度值?？瞻诪?.2mL粗酶液中加入5mL無水乙醇，再加1.5mL底物溶液，于25℃保溫3min，然后加入5mL蒸餾水。

1.3.4 過氧化值測定方法

過氧化值測定方法參見國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5538—2005《動植物油脂過氧化值測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 時間對氧化反應(yīng)的影響

圖1 反應(yīng)時間對氧化反應(yīng)的影響Fig 1 Effect of reaction time on the oxidation reaction

由圖1可知，過氧化值隨著反應(yīng)時間的延長而增加，于5h后趨于平緩，因此5h為較合適的反應(yīng)時間。反應(yīng)開始初期，反應(yīng)時間越長，氧化反應(yīng)進(jìn)行的越充分，當(dāng)反應(yīng)完全之后，隨著時間的增加，過氧化值不再變化。

2.2 溫度對氧化反應(yīng)的影響

圖2 反應(yīng)溫度對氧化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the oxidation reaction

由圖2可知，脂質(zhì)的過氧化值隨著溫度的降低而降低，說明大豆脂肪氧合酶在較低溫度下反應(yīng)活性較高，而溫度太低時脂肪凝固，不易反應(yīng)進(jìn)行，故低于10℃時，過氧化值較低，10℃時，過氧化值最高，故宜選取10℃作為反應(yīng)溫度。

2.3 底物濃度對氧化反應(yīng)的影響

圖3 底物濃度對氧化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the oxidation reaction

由圖3可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，過氧化值也呈增加的趨勢，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度約為225g/L時，氧化產(chǎn)物的過氧化值最高。因?yàn)殡S著底物質(zhì)量濃度的增加，傳質(zhì)面積增大，反應(yīng)進(jìn)行的更加完全。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，可能對反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用，過氧化值隨之降低。故底物質(zhì)量濃度為225g/L時為反應(yīng)較好的選擇。

2.4 pH值對氧化反應(yīng)的影響

圖4 pH值對氧化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH value on the oxidation reaction

由圖4可知，隨著pH值的增大，產(chǎn)物過氧化值增加，當(dāng)pH值為9時，氧化產(chǎn)物的過氧化值最高，之后隨著pH值得增大，過氧化值下降。故pH值為9為反應(yīng)的較佳選擇。

2.5 空氣流速對氧化反應(yīng)的影響

由圖5可知，空氣流速為0.2m3/h時，反應(yīng)產(chǎn)物的過氧化值最大。故空氣流速為0.2m3/h為反應(yīng)的較佳選擇。

2.6 脂肪氧化反應(yīng)條件優(yōu)化

以氧化反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、底物濃度，pH值及空氣流速5個因素設(shè)計正交試驗(yàn)，以確定酶催化脂肪氧化的最佳反應(yīng)條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

圖5 空氣流速對氧化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of air velocity on the oxidation reaction

表1 氧化反應(yīng)條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for oxidation reaction condition optimization

表2 氧化反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for oxidation reaction condition optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，5個因素對氧化反應(yīng)的影響順序是：反應(yīng)溫度＞底物濃度＞反應(yīng)時間＞pH值＞空氣流速。其中氧化溫度是最重要的影響因素。由表3可知，A和D因素的F比均大于1，說明這兩個因素對試驗(yàn)結(jié)果影響較為顯著，是主要影響因素，B、C、E因素為次要影響因素。綜合分析，得到較高過氧化值氧化產(chǎn)物的最優(yōu)氧化反應(yīng)條件組合為A1B4C2D3E3，即反應(yīng)溫度10℃，反應(yīng)時間5h，底物濃度225g/L，pH值為9，空氣流速0.2m3/h。經(jīng)3次驗(yàn)證度驗(yàn)結(jié)果表明，在此最佳條件下，反應(yīng)產(chǎn)物過氧化值可達(dá)180mmol/kg脂肪。

3 結(jié)論

單因素及正交試驗(yàn)的結(jié)果表明，氧化溫度對反應(yīng)的結(jié)果影響最大，空氣流速對反應(yīng)結(jié)果的影響最小，獲得較高過氧化值的最優(yōu)氧化反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度10℃，反應(yīng)時間5h，底物濃度225g/L，pH值9，空氣流速0.2m3/h，在此最佳條件下，最高過氧化值可達(dá)180mmol/kg脂肪。

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