梁 杏，趙聲蘭*，曹冠華，蔡雪梅，程祥云，和小明，陳朝銀

（1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

核桃又名胡桃、羌桃、萬(wàn)歲子，系胡桃科核桃屬植物，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、溫腸補(bǔ)腎、潤(rùn)肺止咳、烏發(fā)健腦等作用。核桃仁含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素E和微量元素等[1-3]。核桃仁螺旋壓榨制油后的餅粕含有豐富的蛋白質(zhì)，是蛋白肽的良好原料，但目前多用于飼料和肥料。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，人類攝取蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用后，并非主要以氨基酸形式吸收，而是以肽的形式吸收[4]，某些低肽不僅能提供人體生長(zhǎng)、發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)具有防病治病、調(diào)節(jié)人體機(jī)能等多種生理功能[5-7]，有些沒(méi)有生物活性的蛋白質(zhì)水解為多肽后會(huì)具有活性，成為生物活性肽[8]。核桃蛋白肽具有溶解度高，受pH值影響小，同時(shí)具備高濃度、低黏度等特點(diǎn)，與核桃蛋白相比，核桃多肽的乳化性、起泡性、吸油性等方面都更加優(yōu)良，此外核桃多肽還具有較強(qiáng)的抗氧化能力及對(duì)超氧陰離子有一定清除作用[9-12]等。本研究采用液態(tài)發(fā)酵法，通過(guò)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝反應(yīng)，將核桃餅粕中的核桃蛋白轉(zhuǎn)化成為核桃多肽，為核桃餅粕的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕：云南匯智源食品有限公司；蛋白質(zhì)含量43.23%，粗脂肪9.90%，粗灰分3.62%，總糖7.56%，水分4.62%[13]。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis natto）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）購(gòu)自云南省微生物研究所菌種保藏中心。

沒(méi)食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

福林酚試劑：稱取20g鎢酸鈉和5.0g鉬酸鈉于圓底燒瓶中，用140mL蒸餾水溶解，加入10mL 85%濃磷酸及20mL濃鹽酸，充分混勻，小火回流10h，稍冷后加入3g硫酸鋰及15mL雙氧水，加熱沸騰（開口）至亮黃色，不帶綠色為止，冷卻，移至250mL容量瓶中，蒸餾水定容，裝入棕色瓶，于4℃條件下保存。10%福林酚試劑：取20mL福林酚試劑加水定容至200mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液配制（100μg/mL）：取0.0050g沒(méi)食子酸對(duì)照品，蒸餾水溶解，定容至50mL。沒(méi)食子酸對(duì)照品工作液：用移液管分別移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，分別用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的沒(méi)食子酸工作液。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂15.0g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏 2g/L，蛋白胨 3g/L，葡萄糖20g/L，檸檬酸鈉3g/L，磷酸氫二鉀10g/L，氯化鈣3g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁pHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDY-12型消化爐、QSY II型凱氏定氮儀：北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心；L-550型低速臺(tái)式離心機(jī)、TG16-WS高速臺(tái)式離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器系統(tǒng)有限公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHWY111B恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；UV759S型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含量測(cè)定

多酚含量的測(cè)定采用福林酚比色法[14-16]。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定按照GB/T5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法。游離氨基酸含量的測(cè)定采用甲醛滴定法。酸溶蛋白氮含量的測(cè)定：發(fā)酵液8500r/min離心10min，取上清液10mL，加入10%三氯乙酸溶液10mL，混合均勻，靜置3min，9500r/min離心5min，取10mL上清液測(cè)定酸溶蛋白氮的含量。多肽含量計(jì)算公式：

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

取14個(gè)500mL三角瓶，分別準(zhǔn)確加入10g核桃餅粕，20g/L葡萄糖溶液20mL，75mL的生理鹽水，121℃、21min滅菌，其中7瓶接種擴(kuò)大培養(yǎng)好的菌種，剩下7瓶作空白對(duì)照，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)7d，每天取一瓶樣品和一瓶空白對(duì)照測(cè)氨基酸含量和酸溶性蛋白含量。

1.3.3 適宜菌種的選擇

測(cè)定水解圈直徑，由于測(cè)量水解圈直徑通常包含菌落直徑，為便于客觀比較，采用了水解圈直徑與菌落直徑比值，該比值越大，說(shuō)明該細(xì)菌所產(chǎn)蛋白酶的活性越高。

1.3.4 菌種液制備

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別各接5環(huán)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h制備各實(shí)驗(yàn)用菌液。

1.3.5 核桃餅粕多酚粗提物的制備

核桃餅粕用5倍量65%vol乙醇95℃回流提取1h，濾液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥即為核桃餅粕多酚粗提物。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選

在用瓊脂2.0g、水100mL、脫脂奶粉3g制備的培養(yǎng)基（pH值7.0～7.2）中挖3個(gè)小孔，3個(gè)小孔中分別加入8μL枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌的菌液，37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察菌落水解圈，測(cè)定水解圈直徑與菌落直徑的比值，結(jié)果納豆芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌未見(jiàn)明顯的水解圈，枯草芽孢桿菌有明顯的水解圈，其水解圈直徑與菌落直徑的比值為1.58，故選擇枯草芽孢桿菌進(jìn)行接種液態(tài)發(fā)酵。

2.2 多酚對(duì)枯草芽孢桿菌菌落生長(zhǎng)和分解蛋白質(zhì)的影響

以脫脂奶粉3g、瓊脂2g、蒸餾水100mL制備培養(yǎng)基（pH值7.0～7.2），滅菌后倒入培養(yǎng)皿，分別將濃度為0.2%、0.5%、3.0%的核桃皮多酚粗提物2mL加入培養(yǎng)基表面，用三角棒平鋪均勻，待表面較干燥后接種枯草芽孢桿菌，同時(shí)做不加核桃多酚粗提物僅接種枯草芽孢桿菌的對(duì)照組和不加核桃皮多酚粗提物、不接種枯草芽孢桿菌的空白組，每組做二組平行實(shí)驗(yàn)，37℃恒溫培養(yǎng)36h～72h，觀察枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)和對(duì)蛋白質(zhì)的水解，結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

表1 枯草芽孢桿菌的菌落直徑Table 1 Colony diameter ofB.subtilis

由表1、表2可知，隨著核桃多酚粗提物濃度的增加，枯草芽孢桿菌菌落生長(zhǎng)受到的抑制作用增加，水解圈直徑與菌落直徑比值變小，當(dāng)核桃多酚粗提物濃度達(dá)3.0%時(shí)，已經(jīng)觀察不到水解圈。核桃多酚粗提物會(huì)抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖及其對(duì)蛋白質(zhì)的水解，故利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵核桃餅粕之前，應(yīng)提取核桃餅粕中的多酚物質(zhì)的，以利于發(fā)酵。

2.3 核桃餅粕中多酚類物質(zhì)的提取

表2 水解圈直徑與菌落直徑比值Table 2 Ratio of hydrolysis circle diameter and colony diameter

2.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取沒(méi)食子酸工作液1mL于10mL容量瓶中，加入5.0mL 10%福林酚試劑，搖勻，5min后加入7.5%碳酸鈉溶液4.0mL（前后時(shí)間間隔不超過(guò)8min），混勻，加水定容，30℃避光放置反應(yīng)1h，在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定其吸光度值。吸光度值（y）與沒(méi)食子酸濃度（x，μg/mL）的回歸方程y=0.0128x+0.0123，r=0.9991，沒(méi)食子酸在0μg/mL～50μg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度值呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]，采用L9（34）正交試驗(yàn)研究提取時(shí)間、溫度和乙醇濃度對(duì)核桃餅粕中多酚類物質(zhì)提取的影響。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3，每組做3次重復(fù)試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表3 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal test for extraction technology optimization

由表4可知，提取時(shí)間、溫度、乙醇濃度對(duì)多酚提取影響由大到小順序是C＞B＞A，即乙醇濃度＞溫度＞時(shí)間，適宜的提取條件為A3B3C1，即提取時(shí)間60min、提取溫度95℃、乙醇濃度65%vol。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多酚含量為7.22%。由表5可知，乙醇濃度對(duì)多酚含量影響顯著，其余2個(gè)因素對(duì)多酚含量影響不顯著。

2.4 枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵核桃餅粕

2.4.1 枯草芽孢桿菌對(duì)核桃餅粕的液態(tài)發(fā)酵

將枯草芽孢桿菌按菌液：發(fā)酵培養(yǎng)基為3∶100的量接種核桃餅粕液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，同時(shí)進(jìn)行不接種枯草芽孢桿菌的空白試驗(yàn)，每天取樣分析測(cè)定樣品組和空白組中的游離氨基酸、酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，發(fā)酵0h～24h，游離氨基酸、酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，發(fā)酵24h～48h，游離氨基酸、酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量有所下降，發(fā)酵48h～96h，游離氨基酸、酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，發(fā)酵96h～168h，酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量趨于平穩(wěn)?？莶菅挎邨U菌液態(tài)發(fā)酵核桃餅粕，可較好地使其蛋白轉(zhuǎn)化為游離氨基酸和多肽，發(fā)酵時(shí)間以酸溶蛋白達(dá)最高時(shí)的拐點(diǎn)（96h）為宜。

表4 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for extraction technology optimization

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results

圖1 游離氨基酸和酸溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Variation of free amino acid and soluble protein content

2.4.2 核桃餅粕多酚對(duì)發(fā)酵的影響

圖2 核桃餅粕多酚對(duì)發(fā)酵中游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of walnut residue polyphenols on free amino acid content during fermentation

圖3 核桃餅粕多酚對(duì)發(fā)酵中酸溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of walnut residue polyphenols on acid soluble protein content during fermentation

圖4 核桃餅粕多酚對(duì)發(fā)酵中多肽含量的影響Fig.4 Effect of walnut residue polyphenols on the content of polypeptide during fermentation

用枯草芽孢桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)分別對(duì)除去和不除去多酚類物質(zhì)的核桃餅粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，每4h取樣測(cè)定游離氨基酸、酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量，同時(shí)進(jìn)行不加枯草芽孢桿菌的樣品對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果（圖2～圖4）可知，核桃餅粕中的多酚對(duì)枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵有一定影響，將核桃餅粕中的多酚提取除去后再進(jìn)行發(fā)酵，有利于發(fā)酵，去除多酚的樣品發(fā)酵液中的游離氨基酸、酸溶性蛋白質(zhì)和多肽含量均高于不去除多酚的樣品20%以上，而且去除多酚后進(jìn)行發(fā)酵，酸溶蛋白達(dá)最高點(diǎn)的發(fā)酵時(shí)間可縮短25%以上。

3 結(jié)論

相比納豆枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)水解核桃餅粕蛋白的能力，是液態(tài)發(fā)酵核桃餅粕的適宜菌種，發(fā)酵時(shí)間以96h為宜。核桃餅粕中的多酚類物質(zhì)會(huì)抑制枯草芽孢桿菌發(fā)酵核桃餅粕，且隨著多酚類物質(zhì)濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)，除去核桃餅粕中多酚類物質(zhì)，可提高發(fā)酵液中的游離氨基酸和多肽含量20%以上，縮短發(fā)酵周期25%以上。核桃餅粕中多酚類物質(zhì)適宜的提取條件為65%vol乙醇，提取溫度95℃，提取時(shí)間1h。

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