劉新建 溫慧敏 黃 英 苗耐英 閆向真 谷曉楓

(廊坊市中國石油中心醫(yī)院，河北 廊坊 065000)

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的細(xì)胞死亡主要形式為細(xì)胞凋亡，并可出現(xiàn)多種凋亡相關(guān)基因表達(dá)〔1，2〕。X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是一種能通過抑制caspase-3、7、9表達(dá)而阻止凋亡級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的凋亡抑制蛋白〔3，4〕。本實驗通過測定新生大鼠HIBD后不同時間點海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況及凋亡抑制蛋白XIAP的表達(dá)變化，旨在從細(xì)胞凋亡的角度探討HIBD病理形成過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 60只新生7日齡Wistar大鼠為研究對象，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，雌雄不限，體重12～18 g。實驗儀器及試劑:石蠟切片機(浙江金華無線電廠)、Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社)、捷達(dá)JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、FACS420型流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)、EnVision試劑盒、鼠抗人XIAP單克隆抗體(工作液濃度為1∶40)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 制模 將60只新生大鼠分為假手術(shù)組(6只)、正常對照組(6只)、HIBD組(48只)，其中HIBD組根據(jù)不同處死時間點分成8個亞組，每組6只。HIBD組制模參照Rice和吳婉芳等的方法。將HIBD組行頸部手術(shù)，分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，造成缺血，術(shù)后恢復(fù)2 h，進(jìn)入8%O2與92%N2混合氣體環(huán)境中缺氧2 h。之后放入母鼠身邊喂養(yǎng)，不作其他處理。假手術(shù)組:行頸部手術(shù)，只暴露左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，也不進(jìn)行缺氧處理。手術(shù)結(jié)束時斷頭取腦。正常對照組:不做任何處理，與假手術(shù)組同時間斷頭取腦。HIBD制模成功后，分別于不同時間點處死動物取腦:HIBD 后 3、6、12、24、48、72 h、7 和 14 d。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡 將新鮮缺氧缺血側(cè)海馬組織在含有磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕柔剪碎，剪碎后組織放離心管中用PBS稀釋為4 ml，反復(fù)吹打20次，沉淀5 min，取上清液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾2次，制成單細(xì)胞懸液，以無水乙醇4℃固定12 h，上機前再用PBS稀釋，再次離心去上清液，加入PI染液，4℃避光放置30 min，24 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。以出現(xiàn)凋亡峰(亞G1峰)為特征。

1.4 檢測XIAP表達(dá) 采用EnVision免疫組化染色檢測XIAP表達(dá)。染色結(jié)果判斷:XIAP定位于海馬神經(jīng)元胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀為陽性信號。每例動物隨機選取5張切片，每張切片在高倍鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)平均陽性細(xì)胞數(shù)/mm2。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件，計量資料采用單因素方差分析進(jìn)行分析，相關(guān)性分析采用Pearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬神經(jīng)元的凋亡率 正常對照組與假手術(shù)組海馬神經(jīng)元凋亡率無顯著差異(P＞0.05)。與假手術(shù)組相比，HIBD組缺氧缺血后3 h海馬神經(jīng)元凋亡率即開始升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);于缺氧缺血后12 h凋亡率顯著升高(P＜0.05)，48 h時達(dá)高峰，72 h時開始下降，7 d時明顯低于高峰水平(P＜0.05)，而與假手術(shù)組無顯著差異，14 d時基本恢復(fù)至假手術(shù)組水平。見表1。

2.2 各組海馬CA1區(qū)XIAP蛋白的表達(dá) 正常對照組和假手術(shù)組海馬CA1區(qū)有極少量XIAP陽性表達(dá)細(xì)胞。HIBD組于缺氧缺血3 h時XIAP陽性表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，之后逐漸升高，在48 h時達(dá)到高峰，72 h時開始逐漸下降，7 d時已明顯低于高峰水平(P＜0.05)，但仍明顯高于正常對照組和假手術(shù)組水平，在14 d時略高于正常對照組和假手術(shù)組表達(dá)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。XIAP蛋白表達(dá)與HIBD后各時間點陽性凋亡細(xì)胞出現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.564，P＜0.05)。見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元的凋亡細(xì)胞率和CA1區(qū)XIAP表達(dá)(n=6，±s)

表1 各組海馬神經(jīng)元的凋亡細(xì)胞率和CA1區(qū)XIAP表達(dá)(n=6，±s)

與假手術(shù)組及正常對照組比較:1)P＜0.05

組別 凋亡細(xì)胞率(%)XIAP表達(dá)(個/mm2)0.50±0.55 2.03±1.05正常對照組 0.33±0.52 1.80±1.03 HIBD組 3 h 2.17±0.98 21.00±4.431)6 h 3.17±1.17 32.00±4.731)12 h 5.67±1.63 45.67±2.881)24 h 13.50±1.871) 62.00±5.221)48 h 23.00±1.411) 75.00±3.161)72 h 10.17±2.321) 53.50±3.271)7 d 2.50±1.05 28.50±1.641)假手術(shù)組14 d 0.50±0.55 5.58±1.06

3 討論

動物實驗顯示，HIBD后各腦區(qū)均有細(xì)胞壞死與凋亡產(chǎn)生，海馬特別是CA1區(qū)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺血缺氧最敏感的區(qū)域，是形態(tài)學(xué)改變和神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡最顯著的部位〔5〕。本研究結(jié)果證實在缺氧缺血腦損傷中存在凋亡現(xiàn)象，且細(xì)胞凋亡形式在HIBD中呈動態(tài)變化過程〔6〕。細(xì)胞凋亡是由多種基因控制的一個細(xì)胞自我消亡過程，涉及多種蛋白表達(dá)異常而形成了復(fù)雜密切的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，有的甚至起到“開關(guān)”樣的作用。其中XIAP是IAPs家族成員中作用最強的成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。已證明XIAP的高表達(dá)對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及預(yù)后均有重要影響〔7，8〕。本文表明XIAP基因的異常表達(dá)出現(xiàn)在HIBD后早期，且高峰表達(dá)與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡高峰時相相吻合，說明XIAP蛋白過度表達(dá)在腦缺氧缺血后細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中起著重要作用。XIAP對HIBD的腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其異常表達(dá)，啟動TNF等介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可能是海馬神經(jīng)元凋亡的發(fā)生機制之一。

1 李開花，曲云霞.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB激活與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2011;32(1):47-9.

2 劉 英，郭世杰，孫景輝，等.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的變化〔J〕.臨床兒科雜志，2011;27(12):1172-6.

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