溫豐標(biāo) 趙 松 楊 洋 劉東雷 吳 愷 趙 佳 齊 宇

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所 鄭州市胸部腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

化療作為一種全身性治療方法應(yīng)貫穿于多種腫瘤治療的始末〔1〕;腫瘤細(xì)胞在治療過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥性，已經(jīng)成為影響化療治療效果的主要因素〔2〕。因此，迫切需要一種方法增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。胰島素作為代謝促進(jìn)劑，已有研究在體外證實(shí)了胰島素可以增加肺癌、肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性〔3，4〕。然而有關(guān)胰島素化療增敏的作用機(jī)制還不甚明了。本實(shí)驗(yàn)旨在探究胰島素對(duì)EC9706細(xì)胞化療敏感性的影響，觀察自噬和凋亡在化療增敏過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 食管鱗癌EC9706細(xì)胞株引自河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞。MTT噻唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)、DDP順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物)、單丹磺酰戊二胺(MDC)熒光染料(美國(guó)Sigma公司)、胰島素注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)、BD FAC CantoⅡ流式細(xì)胞儀(BD公司，USA)、免疫熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)、酶標(biāo)儀等。

1.2 MTT法〔5〕測(cè)定細(xì)胞活力 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，加入順鉑和(或)胰島素溶液，恒溫孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入MTT試劑繼續(xù)孵育4 h，翻板棄上清，加入二甲基亞砜。待藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率(IR)=1-(實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 熒光顯微鏡下定性檢測(cè)T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞自噬和凋亡的表達(dá) 自噬泡(AV)的染色方法按 Biederbick等〔6〕方法來(lái)進(jìn)行。EC9706細(xì)胞在140 μg/ml的順鉑溶液中培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、48 h檢測(cè)細(xì)胞活力，繪制 OD 值-時(shí)間曲線，尋找細(xì)胞數(shù)量達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)T1。再次鋪板，加入順鉑溶液培養(yǎng)至T1時(shí)間點(diǎn)后，再加入10 mU/ml的胰島素，分別在T1、T1+3 h、T1+6 h、T1+9 h檢測(cè)細(xì)胞活力，再次繪制 OD值-時(shí)間曲線，尋找細(xì)胞數(shù)量再次達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)T2。選取在T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞，加入0.05 mmol/L的MDC溶液，37℃避光孵育60 min后棄去染液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min;倒置熒光顯微鏡下觀察并照相。消化、離心收集懸浮細(xì)胞，冷的PBS洗滌細(xì)胞，400 μl 1×Annexin V 結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混勻后2℃ ～8℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液，2℃ ～8℃避光孵育5 min。立即在熒光顯微鏡下觀察熒光情況。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)定量檢測(cè)T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞自噬、凋亡水平 收集T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。MDC染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDC染色的熒光強(qiáng)度。Annexin V-FITC和PI染色，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.3 T1、T2平臺(tái)期時(shí)間點(diǎn)的確定 DDP作用24 h時(shí)活細(xì)胞數(shù)量達(dá)到平臺(tái)期，即T1時(shí)間點(diǎn)為24 h(圖2a)。在T1平臺(tái)期基礎(chǔ)上加入胰島素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，活細(xì)胞數(shù)量再次達(dá)到新的平臺(tái)期T2，即T2時(shí)間點(diǎn)為30 h(圖2b)。

2.4 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化 正常培養(yǎng)的EC9706細(xì)胞為多角型，貼壁伸展緊密生長(zhǎng)，呈鋪路石狀，折光率高，胞體大。經(jīng)DDP處理后活細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞皺縮為圓形、折光率減弱，細(xì)胞間距變大，貼壁能力下降，一些細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)液中，作用時(shí)間越長(zhǎng)，上述表現(xiàn)越明顯。見(jiàn)圖3。

2.5 T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞自噬水平的比較 熒光顯微鏡觀察MDC染色的AV呈淺綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)散布于核周。對(duì)照組中很少見(jiàn)到自噬囊泡，T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞中可見(jiàn)到大量MDC染色的AV，以T1平臺(tái)期尤為顯著，且每個(gè)細(xì)胞中自噬囊泡數(shù)量較T2時(shí)間點(diǎn)明顯增多(圖4)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，T1平臺(tái)期細(xì)胞MDC平均熒光強(qiáng)度(104.9±13.2)明顯高于T2平臺(tái)期(82.6±10.3)及對(duì)照組(13.4±2.5)(P＜0.05)。

圖1 不同濃度DDP對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響

2 結(jié)果

2.1 不同濃度胰島素對(duì)EC9706細(xì)胞數(shù)量的影響 胰島素在6～100 mU/ml時(shí)，對(duì)EC9706細(xì)胞增殖影響很小，刺激細(xì)胞增殖率最高在10%左右，可以忽略不計(jì)。取10 mU/ml作為本試驗(yàn)的胰島素溶液終濃度。

2.2 DDP終濃度的確定 DDP濃度與OD值之間存在線性相關(guān) 關(guān)系(見(jiàn)圖1)，相關(guān)系數(shù)r=-0.001(P＜0.001)，直線回歸方程:OD值=0.462-0.001×DDP濃度(μg/ml)。經(jīng)計(jì)算，DDP作用6 h時(shí)抑制率為30%的藥物濃度(即 IR30%)為138.6 μg/ml，故取 140 μg/ml作為加藥濃度。

圖2 T1、T2平臺(tái)期時(shí)間點(diǎn)的確定

圖3 DDP作用不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)改變(×400)

2.6 T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞凋亡水平的比較 凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜可以被Annexin V-FITC染色，熒光顯微鏡下可以看到細(xì)胞膜呈現(xiàn)明亮的蘋(píng)果綠色，PI染色陽(yáng)性的細(xì)胞會(huì)在整個(gè)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的黃-紅色。對(duì)照組中很少見(jiàn)到Annexin V-FITC染色陽(yáng)性細(xì)胞，T1、T2平臺(tái)期可見(jiàn)到較多的陽(yáng)性細(xì)胞，以T2平臺(tái)期尤為顯著(圖5)。細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，T2平臺(tái)期細(xì)胞凋亡率〔(47.5±5.6)%〕明顯高于 T1平臺(tái)期〔(32.6±4.3)%〕及對(duì)照組〔(1.5±0.4)%〕(P＜0.01)。

圖4 熒光顯微鏡觀察T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞自噬水平(×200)

圖5 T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞凋亡水平的比較(×200)

3 討論

食管癌起病隱襲，大多數(shù)患者在確診時(shí)已達(dá)中晚期，失去了外科治療的最佳時(shí)機(jī)，此時(shí)新輔助化療和(或)聯(lián)合化療為主的綜合治療便成為首選的治療方案。然而，腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生常常導(dǎo)致化療失敗，臨床工作中迫切需要具有化療增敏作用的藥物。胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ和Ⅱ(IGFs)的合成與分泌在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)方面扮演著重要角色〔7〕，然而有關(guān)胰島素化療增敏的作用機(jī)制還不甚明了。

自噬是一個(gè)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)〔8〕，正常細(xì)胞通過(guò)自噬清除過(guò)多的、不必要的蛋白質(zhì)和受損或衰老的細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。越來(lái)越多的證據(jù)表明，各種抗癌藥物可以引起不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬〔9〕。然而，自噬在腫瘤化療增敏中發(fā)揮著什么樣的作用:是促進(jìn)細(xì)胞死亡，還是幫助細(xì)胞存活?目前還存在著諸多爭(zhēng)議〔5，6，10，11〕。研究表明凋亡是化療殺傷腫瘤細(xì)胞的主要形式〔12〕，自噬和凋亡在胰島素化療增敏中扮演著什么樣的角色，是我們關(guān)注的重點(diǎn)。本研究證實(shí)了DDP可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，低濃度胰島素促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用微弱，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以忽略不計(jì)。在此基礎(chǔ)上本文以新穎的思路探究胰島素化療增敏的機(jī)制:先以作用6 h時(shí)抑制率為30%的DDP溶液處理人食管鱗癌EC9706細(xì)胞，找到活細(xì)胞數(shù)量達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間T1。在T1平臺(tái)期的基礎(chǔ)上加入低濃度胰島素(10 mU/ml)，測(cè)得活細(xì)胞數(shù)量再次達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間T2。利用熒光染色技術(shù)，分別對(duì)T1、T2平臺(tái)期細(xì)胞的凋亡和自噬水平進(jìn)行定性和定量研究。結(jié)果顯示胰島素可以增加EC9706細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，增強(qiáng)細(xì)胞殺傷作用。

腫瘤細(xì)胞物質(zhì)、能量代謝活躍，對(duì)環(huán)境的變化敏感，化療的有害刺激導(dǎo)致大量代謝產(chǎn)物、受損蛋白質(zhì)和衰老的細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)蓄積。自噬作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)降解的重要途徑，如果這個(gè)時(shí)候受到抑制，將進(jìn)一步放大化療藥物的細(xì)胞毒性作用。筆者推測(cè)在DDP作用于EC9706細(xì)胞的后期，胰島素可能是通過(guò)自噬抑制途徑增加了腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而實(shí)現(xiàn)其化療增敏作用。自噬是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種抗癌治療的一種自我適應(yīng)、保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果可以考慮腫瘤預(yù)防和治療一個(gè)新的嘗試方向，即通過(guò)藥物和(或)基因抑制自噬，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療、放療和靶向治療藥物的敏感性，提高療效，減少毒副作用，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。

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