關(guān)云哲 楊東彪 王振中 (長春市中心醫(yī)院泌尿外科，吉林 長春 130021)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，每年都有大量新增病例出現(xiàn)，近年來其發(fā)病率在我國仍呈上升趨勢〔1，2〕。手術(shù)是膀胱癌治療的關(guān)鍵，而術(shù)后灌注化療可以有效降低術(shù)后復發(fā)率，改善患者預后和提高生存率〔3〕。研究表明，膀胱癌患者的復發(fā)與膀胱癌治療過程中出現(xiàn)的耐藥性有關(guān)〔4～7〕。目前，順鉑作為作為一線化療藥物在多種腫瘤中使用，但產(chǎn)生的耐藥性嚴重影響了其療效。核苷酸切除修復(NER)是順鉑耐藥的重要機制之一，而ERCC1是NER途徑的重要因素，在順鉑耐受中起著重要作用〔4〕。膜聯(lián)蛋白-1(Annexin-1)是上皮生長因子(EGFR)激酶的主要底酶。由于Annexin-1能增強感染局部的凋亡，因此該蛋白質(zhì)與腫瘤細胞的活性調(diào)節(jié)相關(guān)〔5，6〕。因此，探討ERCC1及Annexin-1對順鉑耐藥機制的影響是克服耐藥、提高療效的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細胞株 KU7、253JB-V和 T24。順鉑(Cisplatin):長春市中心醫(yī)院提供。細胞培養(yǎng)液(DMEM)及胎牛血清:Hyclone(美國);胰酶-EDTA，青、鏈霉素，噻唑藍(MTT)等:Sigma(美國)?？俁NA抽提液TRIZOL:Invitrogen(美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Go-taq DNA聚合酶:Promega(美國);DNA Taq TM Hot Star及DNA marker:TaKaRa(日本)。

1.2 方法

1.2.1 耐藥株細胞培養(yǎng) 三種人表淺性膀胱癌細胞用含10%胎牛血清，終濃度為100 U/ml青霉素、鏈霉素的高糖DMEM液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d傳代繼續(xù)培養(yǎng)細胞。采用分步誘導法，將KU7、253JB-V和T24細胞接種于六孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，實驗組加入低濃度的Cisplatin后，經(jīng)過大約7 d左右的篩選，細胞無因加藥而死亡再逐步提高藥物濃度至0.8 nmol/L(KU7、253JB-V)和0.2 nmol/L(T24)，對照組加入等量的DMSO培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗 選取不同濃度、不同天數(shù)的耐Cisplatin的KU7、253JB-V和T24細胞，細胞密度為2×104/ml，種于9 6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl的細胞液和100 μl的藥物。KU7耐藥株細胞的Cisplatin藥物濃度(nmol/L)范圍依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2;253JB-V 耐藥株細胞的 Cisplatin 藥物濃度(nmol/L)范圍依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.6;T24 耐藥株細胞的Cisplatin藥物濃度(nmol/L)范圍依次為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6。對照組加入同等稀釋度的DMSO。每組設(shè)3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h換藥，至48 h終止培養(yǎng)前加入 MTT(5 g/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后離心，棄上清。加 DMSO 200 μl，避光振蕩15 min，在全自動酶標儀上測定570 nm處吸光度值，描繪細胞增殖曲線，計算細胞生長抑制率及藥物的IC50值。

1.2.3 RT-PCR方法檢測三種細胞株和其耐Cisplatin的細胞株的ERCC1及Annexin-1基因的表達 從細胞株中提取總的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR條件:42℃ 15 min，90℃ 5 min，4℃停止。PCR 引物:β-actin:前向:5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3';反向:5'-AGCTGGCCGGACTCGTCATACT-3';ERCC1:反向:5'-CCAGAGGGCCGGAAGTGAGTC-3';反向:5'-GCACAGGGCACCTCTTCTTCCTC-3';Annexin-1:前向:5'-GACCACCTCAACTCAAGGAC-3';反 向:5'-TCTGAGGTCTTCTCTCTGAAACATC-3';產(chǎn) 物 大 小 分 別 為:621、203、546 bp。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴增循環(huán)參數(shù):95℃預變性5 min，95℃變性30 s;53℃復性40 s;72℃延伸45 s，循環(huán)33次后72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，25 min)，溴乙啶(EB)染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間樣本均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Cisplatin對人表淺性膀胱癌細胞產(chǎn)生的細胞殺傷作用 以不同濃度(nmol/L)的Cisplatin作用于KU7、253JB-V和T24 96 h后，隨著Cisplatin藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，IC50分別為:(0.8±0.29)、(0.3±0.09)、(0.2±0.15)nmol/L。

2.2 驗證構(gòu)建的耐Cisplatin不同濃度、不同天數(shù)的耐藥株細胞 MTT結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，其KU7+0.4 nmol/L Cisplatin(75 d)耐藥株細胞和 KU7+0.8 nmol/L Cisplatin(30 d)耐藥株細胞的 IC50分別為:(1.1±0.3)、(1.25±0.39)nmol/L;253JB-V+0.4 nmol/L Cisplatin(75 d)耐藥株細胞和253JB-V+0.8 nmol/L Cisplatin(30 d)耐藥株細胞的IC50分別為:(1.25±0.41)、(1.37±0.36)nmol/L;T24+0.2 nmol/LCisplatin(90 d)耐藥株細胞的 IC50為:(1.0±0.33)nmol/L?？梢婋S藥物濃度的增加，細胞生長的抑制率逐漸增加。

2.3 Cisplatin作用于KU7、253JB-V和T24細胞及其耐藥株細胞的ERCC1及Annexin-1基因的表達狀態(tài) 見圖1。電泳結(jié)果顯示，在 β-actin一致的條件下，與對照組相比，Cisplatin的KU7、253JB-V細胞ERCC1基因表達水平明顯增多，而Annexin-1基因無明顯變化。對照組的T24細胞和實驗組 T24 0.2 nmol/L(Cisplatin 90 d)耐藥株細胞中ERCC1及Annexin-1基因均沒有明顯的變化。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，同時也是人類腫瘤中最具侵襲性的腫瘤，在西方國家僅次于前列腺癌。早期手術(shù)是膀胱癌患者治療的關(guān)鍵，術(shù)后5年內(nèi)有20% ～80%的患者復發(fā)，這與新發(fā)腫瘤、腫瘤細胞種植或原發(fā)腫瘤切除不完全有關(guān)〔5～8〕。研究表明，膀胱癌患者的復發(fā)除存在腫瘤復發(fā)的高危因素(瘤體大小、數(shù)目、腫瘤的復發(fā)頻率、病理分級等)外，還與治療過程中出現(xiàn)的藥物耐藥性有關(guān)〔9，10〕。

NER是Cisplatin耐藥的重要機制之一〔11〕。NER是一個循環(huán)的過程，其中DNA損傷識別/切除通路作用機制復雜。ERCC1基因是一種高度保守的DNA核酸內(nèi)切酶，其產(chǎn)物與DNA修復酶缺乏互補基因形成緊密的異二聚體(ERCC1-XPF)，在NER中起到調(diào)節(jié)的重要作用〔12，13〕。而 Annexin-1基因能促進細胞凋亡進程，這也表明其對腫瘤的診斷和治療有重要意義，因此說明Annexin-1基因與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔14，15〕。

本研究說明在膀胱癌中ERCC1基因表達因人而異，相對低表達的患者對Cisplatin敏感;而在T24耐藥株中，并沒有發(fā)現(xiàn)其表達變化，這可能與細胞中P53基因突變或個體基因表達差異有關(guān)〔16〕，當然這需要進一步的研究證實。盡管Annexin-1基因在膀胱癌治療中對Cisplatin引起細胞凋亡有調(diào)解作用，但是在三種膀胱癌耐藥株中表達均無明顯變化，也可能在這三種細胞系中，Annexin-1基因不能正常積累mRNA，當然這還需要大量的實驗證實。

目前腫瘤的治療還在探索中，任何單一的手段都難以達到真正的治愈。因此，膀胱癌應(yīng)采用手術(shù)聯(lián)合多種藥物綜合的治療，并根據(jù)患者不同的基因型來做出相關(guān)的治療方案。所以，制訂出個體化的理想治療模式將有助于指導臨床工作，提高膀胱癌整體的治療水平。

圖1 KU7、253JB-V和T24在Cisplatin作用下ERCC1及Annexin-1基因的表達水平

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