殷振娥 何淑梅 劉永哲 金順子 吳叢梅 (長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院，吉林 長春 300)

目前，在我國前列腺癌的發(fā)病率正呈逐年上升趨勢，尤其是中老年患者比例增長較快。傳統(tǒng)的治療方法都具有局限性，嚴(yán)重影響了治療效果和患者的生活質(zhì)量〔1，2〕。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將基因治療作為傳統(tǒng)治療方法的輔助手段，集兩種治療方法的優(yōu)點(diǎn)，避免各自的局限性，是目前研究前列腺癌治療方法的主要方向之一。放射治療是治療前列腺的重要手段之一〔3〕，但是由于其能對腫瘤鄰近部位的正常組織造成損傷，而且很多前列腺癌類型具有輻射抗性，使放射治療前列腺癌的療效和應(yīng)用受到限制〔4，5〕。研究證實(shí)，白細(xì)胞介素-24(IL-24)基因可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，對正常組織卻沒有損傷，同時(shí)可以提高機(jī)體的免疫功能，是一種理想的腫瘤治療基因〔6～8〕。因此就將IL-24基因作為放療的輔助基因，通過提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，來增強(qiáng)前列腺癌的放療效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人類前列腺癌細(xì)胞系PC-3，來自于中國長春吉林大學(xué)，用含10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(GIBCO-BRL;Grand Island，NY，USA)。

1.2 質(zhì)粒 pcDNA-Mda7質(zhì)粒由吳叢梅博士構(gòu)建。即將Mda7 cDNA插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，然后將pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和pcDNA-Mda7質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體lipofectamine(GIBCO-BRL;USA)包裹轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

1.3 方法

1.3.1 集落形成分析 PC-3細(xì)胞接種在6孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中，24 h后，培養(yǎng)基換成無血清DMEM培養(yǎng)基，并將pcDNA-Mda7質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。6 h后，培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染8 h后，胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞重新接種到90-mm的培養(yǎng)皿(Nunc，Roskilde，Denmark)中，繼續(xù)孵育到肉眼可見的集落，14 d后計(jì)數(shù)這些集落，并計(jì)算出集落形成百分比。

1.3.2 細(xì)胞凋亡測定 放射誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PC-3細(xì)胞接種到 12 孔板內(nèi)，24 h 后給予不同劑量 X-射線(0，2，5，10，20 Gy)照射。X-射線照射24 h后，PC-3細(xì)胞系經(jīng)碘化丙啶(PI)染色，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化?；蛘T導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中PC-3細(xì)胞接種12孔板，24 h后，經(jīng)脂質(zhì)體包裹，將pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA-Mda 7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC-3細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)設(shè)空白對照組。24 h染色，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化。聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PC-3細(xì)胞接種于12孔板，分別給予不同的處理:(1)轉(zhuǎn)染組，于接種24 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcD-NA-Mda 7質(zhì)粒;(2)照射組，于拉種32 h后，細(xì)胞分別給予2和8 Gy的X-射線照射;(3)聯(lián)合應(yīng)用組，于接種24 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-Mda 7質(zhì)粒，于接種32 h后，分別給予2和8 Gy和X-射線輻射。于接種38 h后，各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化。對照組沒有經(jīng)過轉(zhuǎn)染或照射處理。

1.4 X-射線照射 X-射線照射機(jī)(Model X.S.S.205 FZ;吉林大學(xué))，劑量率為 0.287 Gy/min，200 kV，10 mA，0.5 mm Cu/0.5 mm Al的過濾器。源物距56 cm。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用χ2和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 輻射誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡 X-射線輻射誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞細(xì)胞凋亡呈劑量隨照射劑量升高而增加。2 Gy和5 Gy X-射線可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡〔(7.04±1.41)%、(8.24±0.33)%〕，但與0 Gy對照組相比沒有顯著性差別〔(6.15±0.24)%〕。10 Gy和 20 Gy X-射線照射后，PC-3細(xì)胞凋亡率明顯增加〔(8.74±0.35)%，(20.78±1.95)%，P＜0.01〕，是 0 Gy對照組的1.58～3.38倍。

2.2 Mda7誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡 與空白對照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的細(xì)胞相比，pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他兩組(P＜0.001)。因此表明，pcDNA-Mda7質(zhì)粒能夠在PC-3細(xì)胞中正常表達(dá)，并誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。

2.3 Mda7抑制PC-3細(xì)胞集落形成 PC-3細(xì)胞接種6孔板，將pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA-Mda7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC-3細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)設(shè)空白對照組。采用集落形成法檢測Mda7抑制PC-3細(xì)胞生長的作用。(A)正常細(xì)胞對照組，細(xì)胞集落形成最多;(B)pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞集落形成比正常細(xì)胞對照組多;(C)pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞集落形成最少。計(jì)數(shù)集落形成數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，pcDNAMda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞集落形成數(shù)量最低，為(620±18)個(gè)，明顯低于正常細(xì)胞對照組〔(1 288±141)個(gè)，P＜0.001〕和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組〔(1 104±107)個(gè)，P＜0.001〕，約為正常對照組的0.5倍。見圖1。

圖1 PC-3細(xì)胞集落形成

2.4 X-射線聯(lián)合pcDNA-Mda7誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡 與對照組相比，單純pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率是(9.64±0.69)%，單純8 Gy的 X-射線照射組細(xì)胞凋亡率是(7.67±1.23)%，這兩組明顯高于對照組〔(4.98±0.16)%，P＜0.01〕;而單純2 Gy X-射線照射組細(xì)胞凋亡率是(6.35±0.31)%與對照組相比沒有明顯變化;在聯(lián)合應(yīng)用組中，轉(zhuǎn)染了pcDNA-Mda7質(zhì)粒的PC-3細(xì)胞并分別給予2 Gy和8 Gy X射線照射，細(xì)胞凋亡率分別為(12.74±2.68)%和(18.39±0.17)%明顯高于對照組和2、8 Gy單純X-射線照射組和單純轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。

3 討論

多種前列腺癌對輻射的抗性使這種惡性疾病的臨床治療方法受到限制，也影響了治療結(jié)果，有研究報(bào)道，Mda7基因可以抑制前列腺癌細(xì)胞的生長〔8，9〕，也可以增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞的放射敏感性〔6〕。

在本研究中，選擇前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，首先檢測其輻射敏感性，結(jié)果證實(shí)PC-3細(xì)胞具有輻射抗性;同時(shí)Mda7基因可以用來抑制PC-3細(xì)胞生長，但是，由于分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展有限，作為單獨(dú)的基因治療，受到安全性和有效性的限制。2 Gy照射與pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染聯(lián)合應(yīng)用，可以顯著提高細(xì)胞凋亡率。此結(jié)果說明，聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到提高腫瘤治療效果和減輕對正常組織損傷的目的。本研究結(jié)果初步確定了聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢，為下一步的機(jī)制研究和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Shen ZJ，Chen SW，Wang H，et al.Life-threatening meningitis resulting from transrectal prostate biopsy〔J〕.Asian J Androl，2005;7(4):453-5.

2 Wang Y，Shao C，Shi CH，et al.Change of the cell cycle after flutamide treatment in prostate cancer cells and its molecular mechanism〔J〕.Asian J Androl，2005;7(4):375-80.

3 錢 明，趙慧紅.快中子放療在前列腺癌治療中的應(yīng)用〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊，2000;27(3):187-8.

4 Rosser CJ，Reyes AO，Vakar-Lopez F，et al.Bcl-2 is significantly overexpressed in localized radio-recurrent prostate carcinoma，compared with localized radio-naive prostate carcinoma〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2003;56(1):1-6.

5 Xu L，Yang D，Wang S，et al.(-)-Gossypol enhances response to radiation therapy and results in tumor regression of human prostate cancer〔J〕.Mol Cancer Ther，2005;4(2):197-205.

6 Su ZZ，Lebedeva IV，Sarkar D，et al.Ionizing radiation enhances therapeutic activity of mda-7/IL-24:overcoming radiation-and mda-7/IL-24-resistance in prostate cancer cells overexpressing the antiapoptotic proteins bcl-xL or bcl-2〔J〕.Oncogene，2006;25(16):2339-48.

7 Madireddi MT，Su ZZ，Young CS，et al.Mda-7，a novel melanoma differentiation associated gene with promise for cancer gene therapy〔J〕.Adv Exp Med Biol，2000;465(1):239-61.

8 Saito Y，Miyahara R，Gopalan B，et al.Selective induction of cell cycle arrest and apoptosis in human prostate cancer cells through adenoviral transfer of the melanoma differentiation-associated-7(mda-7)/interleukin-24(IL-24)gene〔J〕.Cancer Gene Ther，2005;12(3):238-47.

9 Mhashilkar AM，Schrock RD，Hindi M，et al.Melanoma differentiation associated gene-7(mda-7):a novel anti-tumor gene for cancer gene therapy〔J〕.Mol Med，2001;7(4):271-82.