符少月 焦慶昉 黃啟彬 易發(fā)平

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

人乳頭狀瘤病毒(HPV)的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌的最普遍因素〔1，2〕。中國 HPV高危險(xiǎn)因素的宮頸癌患者約為14.51%，其中每年的新發(fā)病率約為9.6/10萬人，死亡率約為4.3/10萬人〔3〕。因此研制HPV疫苗對宮頸癌的預(yù)防與治療具有重大意義。樹突細(xì)胞(DC)被認(rèn)為是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，能夠激活T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，啟動(dòng)人體的特異性免疫，溶解殺傷腫瘤細(xì)胞，因此DC成為研究腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞CaSki(中國上海生命科學(xué)研究院);帶有HPV-16 E6/E7基因的重組腺病毒載體、空載體由本課題組成功構(gòu)建〔4〕;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液(美國 Gibco公司);小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)、重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(美國Peprotech公司);鼠抗E7多克隆抗體(Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、ECL發(fā)光試劑和CCK8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品公司);鼠抗CD4單克隆抗體(Abcam公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉公司)。C57BL/6小鼠，4～5周齡，雄性(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);BALB/c小鼠，6～8周齡，雌性(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)于SPF房間。裸小鼠，4～5周齡，雌性(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)于IVC房間。證書編號(hào):CQLA-2011-0047。

1.2 HPV-l6 E6/E7樹突細(xì)胞疫苗的制備 處死C57BL/6小鼠，無菌操作取出股骨和脛骨，剔除肌肉組織，用無菌1 ml注射器吸取PBS沖洗骨髓腔，獲得骨髓。1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，加入4 ml紅細(xì)胞裂解液吹散并靜置5 min，然后1 000 r/min離心10 min。用RPMI1640洗滌2遍，收集細(xì)胞并加入RPMI1640完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為3×109個(gè)/ml接種于6孔板，加入細(xì)胞因子rmGM-CSF和rmIL-4并調(diào)整其濃度為10 ng/ml。培養(yǎng)48 h后半量換液，并補(bǔ)足相同濃度的細(xì)胞因子。每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。收集培養(yǎng)至第6天的未成熟樹突細(xì)胞(imDCs)，分別加入感染復(fù)數(shù)為200的腺病毒pAd-E6/E7和空載體pAd-mock。于6孔板中培養(yǎng)2 h后，再加入含細(xì)胞因子rmGM-CSF和rmIL-4的細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞因子濃度為5 ng/ml。繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別提取pAd-E6/E7感染的DC、pAd-mock感染的DC及未成熟DC的總蛋白。按每孔蛋白上樣量為30 μg進(jìn)行12%的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，采用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，1∶200稀釋的鼠抗E7多克隆抗體于4℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次5 min，1∶1 000 HRP標(biāo)記的IgG室溫孵育1 h，ECL顯色，檢測目的蛋白E7的表達(dá)。

1.3 DC疫苗對裸鼠體內(nèi)宮頸癌的抑制作用 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，分別為pAd-E6/E7-DC組(樹突細(xì)胞疫苗組)、pAd-mock-DC組(樹突細(xì)胞空載體組)、DC組(樹突細(xì)胞組)。背部左側(cè)皮下注射，每只200 μl、細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml的pAd-E6/E7-DC、pAd-mock-DC和DC，空白對照組注射200 μl PBS。每7 d免疫1次，共3次。第21天處死各組小鼠，無菌條件下取出脾臟，制成單細(xì)胞懸液。1 500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，加入4 ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液吹散，再于液面上輕輕加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)液，2 000 r/min垂直離心30 min，輕輕吸出第二層乳白色細(xì)胞層。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌兩次獲得CTL。與分組相對應(yīng)簡稱為pAd-E6/E7-DC-CTL、pAd-mock-DC-CTL、DC-CTL。將 16 只裸鼠隨機(jī)分成4組，分別為pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki組、pAd-mock-DC-CTL-CaSki組、DC-CTL-CaSki組和 CaSki組(空白對照)。先于每組小鼠背部左側(cè)皮下注射200 μl細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml的CaSki細(xì)胞，3 d后各組分別腹腔注射500 μl細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml的 pAd-E6/E7-DC-CTL、pAd-mock-DC-CTL和DC-CTL，CaSki組注射500 μl PBS。每天觀察裸小鼠的生長狀況，腫瘤長出后每7 d測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，繪制腫瘤生長曲線。

1.4 CCK8法檢測免疫BALB/c小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖將BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組4只，分別為pAd-E6/E7-DC組(樹突細(xì)胞疫苗組)、pAd-mock-DC組(樹突細(xì)胞空載體組)、DC組(樹突細(xì)胞組)、PBS組(空白對照組)。背部左側(cè)皮下注射，每只200 μl、細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml的 pAd-E6/E7-DC、pAd-mock-DC 和 DC，空白對照組注射 200 μl PBS。每7 d免疫1次，共3次。第21天處死各組小鼠，無菌條件下取出脾臟，按1.3法離心收集淋巴細(xì)胞，加入2 ml培養(yǎng)液重懸。取100 μl細(xì)胞液接種于96孔板中，以完全培養(yǎng)液作為對照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按CCK 8檢測試劑盒方法測定細(xì)胞增殖效應(yīng)，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值(OD)，波長為450 nm。各組OD值 =各實(shí)驗(yàn)組 OD值-空白對照組OD值。計(jì)算平均值為最終OD值。

1.5 免疫組化法檢測裸鼠脾臟組織CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)處死腫瘤生長第28天裸鼠，分離脾臟組織，固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，血清封閉30 min，滴加一抗(CD4+，1∶50)4℃過夜，加生物素化二抗，滴加HRP標(biāo)記的親和素37℃ 30 min，DAB顯色，蘇木精染色，碳酸鋰返藍(lán)約10 s，烘干，樹脂封片，檢測CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HPV-16 E6/E7樹突細(xì)胞疫苗的制備 細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密且多，很多懸浮成簇、呈集落狀生長，即為未成熟的樹突細(xì)胞，見圖1箭頭所示。于第6天收集未成熟的DC，加入重組腺病毒載體(pAd-E6/E7)和空載體(pAd-mock)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)36 h，Western印跡檢測，發(fā)現(xiàn)pAd-E6/E7-DC組有一條目的蛋白E7的表達(dá)，兩個(gè)對照組pAdmock-DC組和DC組中無表達(dá)，見圖2。

圖1 培養(yǎng)第5天小鼠未成熟DC形態(tài)(×100)

圖2 Western印跡檢測各組E7蛋白的表達(dá)

2.2 CCK8法檢測免疫BALB/c小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖pAd-E6/E7-DC組小鼠的OD值(0.681 3±0.051 5)高于對照組pAd-mock-DC組(0.590 4±0.035 0)DC組(0.584 9±0.053 2)和 PBS組(0.462 4±0.081 5)(P＜0.05、P＜0.01)。

2.3 免疫組化法檢測裸鼠脾臟組織CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki組 CD4+表達(dá)量最高，pAd-mock-DC-CTL-CaSki組和DC-CTL-CaSki組CD4+表達(dá)量次之，CaSki組CD4+表達(dá)量最低。見圖3。

2.4 裸鼠的腫瘤體積分析 隨著時(shí)間的延長CaSki組腫瘤體積不斷變大，pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki組、pAd-mock-DC-CTLCaSki組和DC-CTL-CaSki組的腫瘤體積不斷減小，pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki組的腫瘤體積減小幅度最大。見圖4。

圖3 各組裸鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)

圖4 各組小鼠腫瘤體積變化曲線

3 討論

HPV 16的持續(xù)感染引起宮頸癌、陰道癌、外陰癌、肛門癌、口咽癌等，而在這些腫瘤當(dāng)中，最引人矚目的是表達(dá)特異性E6和E7蛋白的宮頸癌〔5〕。宮頸癌的致病機(jī)制被認(rèn)為與E6、E7蛋白的早期表達(dá)密切相關(guān)〔6〕。E6蛋白可以誘導(dǎo)端粒酶活性，進(jìn)而維持端粒長度而使上皮細(xì)胞出現(xiàn)永生化。而E7蛋白通過CR1與Rb蛋白的相關(guān)因子-p600作用，促進(jìn)細(xì)胞的獨(dú)立生長及轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引起上皮細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)化、永生化〔7〕。因此，基于E6、E7基因的腫瘤生物治療已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

目前已經(jīng)有兩個(gè)預(yù)防性HPV疫苗獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局承認(rèn)，但是預(yù)防性疫苗對已經(jīng)存在的HPV感染和HPV相關(guān)的病變沒有治療作用〔8〕，而且由于全球HPV感染范圍之大，預(yù)防性疫苗需要花幾十年的時(shí)間才能對流行的宮頸癌起到作用。為了加快控制宮頸癌患者增長的速度，研制HPV治療性疫苗至關(guān)重要〔9〕。DC是有效的抗原提呈細(xì)胞，能夠激活初始型T淋巴細(xì)胞，在機(jī)體感染或接種疫苗時(shí)是誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的重要因素〔10，11〕。DC疫苗在抗腫瘤免疫應(yīng)答中顯示出巨大的潛能〔12〕。近年來，DC疫苗的臨床試驗(yàn)也已經(jīng)應(yīng)用到前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、腎細(xì)胞瘤等的治療，并取得一定效果〔13〕。但基于不同腫瘤的DC疫苗研制，尚需進(jìn)一步探討。

本研究表明HPVl6E6E7基因修飾的DC疫苗能夠抑制腫瘤生長。DC疫苗促進(jìn)了DC疫苗免疫的BALB/c小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增殖。DC疫苗能夠捕捉腫瘤抗原，溶解處理后與組織相容性復(fù)合物(MHC)-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子結(jié)合形成MHC分子-抗原肽復(fù)合物，表達(dá)于細(xì)胞表面，提呈給T細(xì)胞，在此過程中DC細(xì)胞逐漸成熟，許多黏附分子、共刺激分子表達(dá)上調(diào)，為T細(xì)胞提供第二活化信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、分化、產(chǎn)生CTL，殺傷腫瘤細(xì)胞〔14〕。

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