陶國(guó)全 李國(guó)新 葛恒發(fā) 郭久兵 董漢章 于 仁

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510515)

有調(diào)查研究指出我國(guó)結(jié)直腸癌術(shù)后3年內(nèi)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高達(dá)80.2%〔1〕。LATS2基因?yàn)?LATS腫瘤抑制家族成員，一旦LATS2在細(xì)胞表達(dá)異常，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔2〕。Nimmo等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)LATS2在大腸癌等位基因的失衡率最高。因此，LATS2可能與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。本研究擬探討LATS2在大腸癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 77例結(jié)直腸癌標(biāo)本及30例正常組織標(biāo)本收集自南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院2010～2011年存檔標(biāo)本，其中男45例，女32例，年齡35～91〔平均(60.2±24.1)〕歲。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn):I期+Ⅱ期55例，Ⅲ期+Ⅳ期22例;組織學(xué)分級(jí)高、中、低分化分別為17、46、14例。納入標(biāo)本的病例術(shù)前均未接受放療和化療。另外收集了20例活體結(jié)直腸癌及最遠(yuǎn)端切緣的腸黏膜組織(術(shù)后病理予以證實(shí))。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 兔抗人LATS2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)sigma公司;兔抗人LATS2抗體及鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒均購(gòu)自上海藍(lán)基生物有限公司。在樣本組織癌灶和遠(yuǎn)端組織進(jìn)行取材，4%多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片2張，切片厚4～6 μm。分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 RNA、miRNA提取及RT-PCR 取液氮中保存組織，利用總RNA提取試劑盒(天根)提取樣本總RNA。PCR反應(yīng)體系20 μl，cDNA 模 板 1 μl，上 下 游 引 物 各 1 μl，2 × Taq PCR Master-mix 10 μl，用雙氧水(ddH2O)補(bǔ)足至 20 μl。

反應(yīng)條件:95℃，5 min;95℃，20 min;60℃，20 min;72℃，30 min，循環(huán)數(shù)26次。取5 μl產(chǎn)物加1 μl 6倍上樣緩沖液上樣，置于含溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。用 IPWIN 6.0分析軟件對(duì)圖片上每個(gè)條帶進(jìn)行灰度、面積掃描，以β-肌動(dòng)蛋白(β-action)為內(nèi)參，半定量LATS2 mRNA水平表達(dá)。

PCR反應(yīng)體系:miRNA RT產(chǎn)物 2 μl，miR特異引物(5 μmol/L)0.5 μl，2 × Taq PCR Master-mix(天根)10 μl，用ddH2O補(bǔ)足至20 μl。如上反應(yīng)條件，在High Performance Ultraviolet Transilluminator(UVP)凝膠成像系統(tǒng)上掃描，并分析擴(kuò)增條帶是否符合目的條帶，利用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度、面積掃描，以U6為內(nèi)參，半定量miRNA水平表達(dá)。

1.4 Western印跡 將保存液中保存的大腸癌及癌旁組織取出剪碎，37℃搖動(dòng)孵育2 h，洗膜，100℃4 min變性。每條6%SDS-PAGE凝膠泳道上樣60 μg蛋白，以4℃100 V 100 min條件將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(MILLIPORE:KOEA2380C)上，LATS2(proteintech，1∶400)4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(中杉ZB-2301、ZB-2305，1∶5 000)室溫2 h，設(shè)內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物，取擴(kuò)增產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，分析所測(cè)電泳條帶的性質(zhì)，電泳條帶經(jīng)Image J軟件處理，目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值代表目的蛋白的表達(dá)水平。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒為L(zhǎng)ATS2蛋白表達(dá)陽(yáng)性，每張切片以陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色程度兩項(xiàng)得分乘積作為最后得分:總計(jì)分＜2分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LATS2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá) 77例結(jié)直腸癌組織中LATS2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為35.1%(27/77)，明顯低于正常癌旁組織65%(13/20)(χ2=6.741，P=0.007)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，LATS2蛋白主要在腫瘤細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，部分表達(dá)于胞核，癌組織中無(wú)表達(dá)或者低表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.2 結(jié)直腸癌及癌旁組織LATS2 mRNA蛋白水平比較 癌組織(0.92±0.15)與癌旁正常組織(1.58±0.12)LATSα mRNA表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，癌旁正常組織組中LATS2表達(dá)明顯高于癌組織。見(jiàn)圖2。

圖1 LATS2在結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖2 LATS2在結(jié)直腸組織及正常組織中的表達(dá)

3 討論

LATS2基因定位于13q11-q12，有8個(gè)外顯子，編碼由1 081殘基組成的蛋白質(zhì)。LATS基因于1995年在果蠅(Drosophilamelanogaster)中首次發(fā)現(xiàn)〔4〕，并且隨后在出芽酵母 (dbf2，cbk1)、裂殖酵母(orb6)、線蟲(chóng)(cLats)、鼠(Lats1，Lats2)以及人類(lèi) (LATS1，LATS2)均發(fā)現(xiàn)了保守的同源基因〔4～6〕。大量研究證明，人LATS2與白血病、肺癌、乳腺癌、食道癌等惡性腫瘤發(fā)病相關(guān)，這些研究結(jié)果提示LATS2在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能扮演重要的角色。相關(guān)研究表明LATS2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平與癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，LATS2的低表達(dá)可能參與癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程，證明LATS2基因?qū)︻A(yù)測(cè)癌的病情進(jìn)展、靶向治療和早期病變篩查具有一定的意義〔7〕。

Sivarajasingham等〔8〕利用免疫組化和PCR分析了23名患者的結(jié)直腸癌標(biāo)本，結(jié)果顯示13q11.2-11區(qū)域的等位基因失衡率最高，而此區(qū)也是LATS2基因所在區(qū)域，因此LATS2可能與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。本研究顯示結(jié)直腸癌石蠟病理切片中LATS2表達(dá)明顯癌旁正常組織。綜上所述，本研究證明了LATS2在結(jié)直腸癌中呈低表達(dá)，可能為潛在的抑癌基因或原癌基因，推斷LATS2可能在癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中共同發(fā)揮重要作用。這種潛在的作用可能為治療結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)，對(duì)未來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)直腸腫瘤預(yù)后提供正確評(píng)價(jià)。

1 汪 路，孟慶勇，王小軍，等.結(jié)腸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素分析〔J〕.中國(guó)腫瘤，2007;16(8):646-8.

2 章艷茹，于 珍，邱錄貴.LATS2基因與腫瘤〔J〕.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2013;40(1):3-5.

3 Nimmo RA，Slack FJ.An elegant miRror:microRNAs in stem cells，developmental timing and cancer〔J〕.Chromosoma，2009;118(4):405-18.

4 Ji L，Nishizaki M，Gao B，et al.Expression of several genes in the human chromosome 3p21.3 homozygous deletion region by an adenovirus vector results in tumor suppressor activities in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Res，2002;62(9):2715-20.

5 李業(yè)霞，曹進(jìn)能，祁麗花，等.鹽酸吉西他濱對(duì)乳腺癌小鼠Tusc2、Lats2基因表達(dá)的影響〔J〕.解剖學(xué)報(bào)，2010;41(6):832-6.

6 姜 政，胡 錦，李新鋼，等.SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人腦原發(fā)膠質(zhì)瘤中LATS1和LATS2基因的表達(dá)〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2006;44(12):1289-93.

7 Takahashi Y，Miyoshi Y，Takahata C，et al.Down-regulation of LATS1 and LATS2 mRNA expression by promoter hypermethylation and its association with biologically aggressive phenotype in human breast cancers〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(4):1 380-5.

8 Sivarajasingham NS，Baker R，Tilsed JV，et al.Identifying a region of interest in site-and stage-specific colon cancer on chromosome 13〔J〕.Ann Surg Oncol，2003;10(9):1095-9.