秦福芳 孫 倩 邵鳳民 閻 磊 (鄭州人民醫(yī)院特需科，河南 鄭州 450003)

腎小球系膜細胞增生是多種腎小球疾病的病理改變，也是腎小球硬化的重要病理基礎(chǔ)〔1〕。人細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)作為一種細胞周期正控蛋白，在細胞周期G1和S期過程中有重要的作用〔2〕。血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)受體拮抗劑 (ARB)氯沙坦在受體水平阻斷AngⅡ的作用，而該藥物對腎臟的保護作用日益受到關(guān)注〔3，4〕。本實驗主要觀察氯沙坦對T細胞分化抗原1(Thy1)腎炎大鼠系膜細胞CDK2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 挑選108只Wistar雄性大鼠，體重160～200 g，采用隨機方式把大鼠分成三組:(1)對照組;(2)Thy1腎炎組，尾靜脈注射兔抗大鼠胸腺細胞血清(0.5 ml/kg);(3)服用氯沙坦的Thy1腎炎組，尾靜脈注射抗血清后立即給予纈沙坦溶液(500 mg/L)每組36只。以1、3、5、7 d為標準把三組分別設(shè)為4個時間點，每個時間點9只。

1.2 觀察指標及方法 (1)腎臟病理:采用4 μm的石蠟切片(HE、PAS、PASM)并用透射電鏡檢查。計數(shù)腎小球有核細胞(PAS染色切片)，計算系膜區(qū)占腎小球面積百分比(PASM染色切片，點計數(shù)法)。取20個皮質(zhì)區(qū)的腎小球，計數(shù)并計算其平均值。(2)免疫組化:用升汞-苦味酸混合固定液固定腎組織標本，隨后用石蠟包埋、切片，保持切片的厚度為4 μm。鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法檢測腎小球CDK2和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況，并對結(jié)果進行半定量分析(CMIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng))。(3)首先分離腎小球，并提取其總蛋白，最后用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量。采用Western印跡分析腎小球CDK2的表達情況蛋白含量用平均光密度的OD值和其面積的乘積表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理學(xué)研究 注射兔抗大鼠胸腺細胞血清(ATS)，1 d后觀察，發(fā)現(xiàn)腎小球內(nèi)部出現(xiàn)了系膜溶解和炎細胞浸潤現(xiàn)象，系膜細胞的數(shù)量明顯減少，在少數(shù)腎小球內(nèi)部，毛細血管發(fā)生擴張，最終形成微動脈瘤。ATS注射3～7 d后觀察，發(fā)現(xiàn)系膜溶解征逐漸消退，系膜細胞增生，并且在腎小球內(nèi)部，有核細胞數(shù)量不斷增多，積聚了大量的系膜基質(zhì)。3～7 d后與Thy 1腎炎組相比，氯沙坦腎炎組的系膜細胞增生和系膜擴張程度較輕，并且縮短了系膜的修復(fù)時間。見表1。

2.2 免疫組化結(jié)果 對照組腎小球PCNA的表達量極少，幾乎沒有表達CDK2。對比而言，在Thy1組和氯沙坦腎炎組的腎小球內(nèi)部，PCNA和CDK2表達有逐漸增高的趨勢。在5～7 d時達到最高量。在第3、5、7天時間點，氯沙坦腎炎組PCNA和CDK2表達低于Thy1組(P＜0.05)。見表2。

2.3 Western印跡分析 對照組內(nèi)CDK2表達量最低，并且在腎小球內(nèi)系膜細胞增生時其表達量增加，第5天時達最大值。氯沙坦腎炎組的CDK2比對照組高，并會隨增生而表達量增加表達量，在第5天時最高。氯沙坦腎炎組的表達量明顯低于Thy1組(P＜0.05)。見表2，圖1。

表1 腎小球有核細胞計數(shù)及系膜區(qū)面積/腎小球面積的百分比(±s)

表1 腎小球有核細胞計數(shù)及系膜區(qū)面積/腎小球面積的百分比(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與氯沙坦腎炎組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 腎小球有核細胞數(shù)/腎小球系膜區(qū)面積/腎小球面積(%)56.1±9.6 11.43±1.08第3天 56.2±9.5 11.42±1.06第5天 56.3±9.7 11.43±1.07第7天 56.1±9.6 11.43±1.09 Thy1組 第1天 44.1±5.3 9.02±1.80第3天 61.9±7.9 19.0±4.122)第5天 81.5±5.22) 23.88±1.002)第7天 78.9±6.52) 27.01±3.992)氯沙坦腎炎組 第1天 46.1±6.4 9.43±2.01第3天 49.3±7.03) 13.89±1.411)3)第5天 71.1±6.51)4) 17.00±1.922)3)第7天 68.8±8.21)3) 18.99±5.012)4)對照組 第1天

表2 各組腎小球系膜細胞PCNA、CDK2的表達(±s)

表2 各組腎小球系膜細胞PCNA、CDK2的表達(±s)

組別 PCNA CDK2 CDK2 Western印跡分析0.40±0.11 7.98±0.88 0.19±0.05第3天 0.41±0.12 7.99±0.83 0.20±0.06第5天 0.43±0.11 7.98±0.87 0.17±0.05第7天 0.40±0.10 8.01±0.89 0.19±0.04 Thy1組 第1天 1.01±0.142) 4.03±0.532) 1.41±0.232)第3天 4.68±1.012) 3.42±0.382) 3.42±0.062)第5天 10.99±1.982) 3.65±0.562) 4.75±0.322)第7天 9.12±1.542) 5.96±0.992) 3.99±0.022)氯沙坦腎炎組 第1天 1.05±0.312) 4.32±0.662) 1.06±0.082)4)第3天3.52±0.332)3)4.98±0.452)4) 2.38±0.032)4)第5天8.01±0.432)3)4.73±0.542)3) 3.04±0.152)4)第7天7.18±0.992)3) 7.22±0.163) 2.73±0.171)3)對照組 第1天

3 討論

很多腎小球疾病會表現(xiàn)為腎小球系膜細胞增殖，因此，研究腎小球系膜細胞增生的機制，并最終阻止其發(fā)展有著非常重要的意義。細胞增殖的基礎(chǔ)是細胞周期，各種促增殖因子對細胞的影響作用最后會反映在細胞周期上。細胞周期調(diào)控蛋白會控制細胞周期的正常進行，其中一個重要的細胞周期調(diào)控蛋白是 CDK2〔5〕。

圖1 Western印跡分析CDK2表達變化

CDK2是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在G1期能與細胞周期素E結(jié)合，而在S期則和周期素A結(jié)合，進而形成周期素，即CDK2復(fù)合物，這種周期素具有全酶活性，能有效促進細胞周期的順利進行。用血小板衍生生長因子(PDGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)刺激的體外試驗，促使系膜細胞增生，CDK2蛋白水平會明顯升高〔6〕。在本試驗中，正常大鼠腎小球靜止期系膜細胞的CDK2表達水平極低。相反，抗Thy6系膜增殖性腎炎模型中CDK2在腎小球系膜細胞增殖時有明顯上調(diào)的趨勢。CDK2表達水平隨細胞增生程度的提高而提高。當大鼠處于病理狀態(tài)下時，CDK2的表達水平與系膜細胞增生具有顯著相關(guān)性。因此，CDK2作為作用靶點很可能對系膜增殖性腎炎的治療有重要的意義。Dousa等指出，為有效降低CDK2的表達，抑制因子Olomousine很可能發(fā)揮重要的作用。病理狀態(tài)下，腎組織局部的AngⅡ濃度可達到血漿AngⅡ1 000倍左右，能促進腎小球疾病的發(fā)生，可見，阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)能防治腎臟疾病〔7，8〕。

本試驗發(fā)現(xiàn)，氯沙坦能明顯減輕腎炎大鼠的系膜細胞增生及系膜擴張程度，CDK2表達降低。說明氯沙坦在一定程度內(nèi)能抑制腎小球系膜細胞CDK2的表達，氯沙坦的作用機制與其抑制系膜細胞CDK2表達相關(guān)。該研究為氯沙坦的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

1 馬祖祥，何小解，趙維玲，等.pRb的磷酸化狀態(tài)在腎小球系膜細胞增生和凋亡中的作用〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2010;11(9):774-6.

2 余榮杰，楊惠標，趙景宏，等.纈沙坦對Thy1腎炎大鼠腎小球系膜細胞CDK2表達的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2007;8(2):81-3.

3 Wolf G.Angiotensin II as a renal growth factor〔J〕.Contrib Nephrol，2011;135(11):92-110.

4 Wolf G，Wenzel UO.Angiotensin II and cell cycle regulation〔J〕.Hypertension，2004;43(4):693-8.

5 De Wolf WC，Gaston SM.The cell cycle and its relevance to the urologist〔J〕.Urol，2004;171(4):1674-81.

6 Shankland SJ，Douahji M.Cell cycle regulatory proteins in glomerular disease〔J〕.Exp Nephrol，2009;7(3):207-11.

7 Cantarovich F，Rangoonwala B.Therapeutic effects of angiotensin Ⅱinhibition or blockade on the progression of chronic renal disease〔J〕.Int J Clin Prac，2003;57(9):801-22.

8 朱詩平，孫升云，馮偉峰.氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織ACE2mRNA、TGF-β1mRNA 表達的影響〔J〕. 中國老年學(xué)雜志，2012;32(5):968-71.