蘇 偉 高 楓 孫茂民 江家貴 (南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 2400)

正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管收縮與舒張。當(dāng)內(nèi)皮損傷時(shí)，氧自由基生成增加，舒血管物質(zhì)如前列環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮源性舒血管因子〔(EDRF，即一氧化氮(NO)〕等釋放減少，而內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(XA2)等縮血管物質(zhì)釋放增多。血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)損傷是動(dòng)脈硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)〔1〕，當(dāng)VECs受損時(shí)，可導(dǎo)致血壓增高、動(dòng)脈硬化等疾病〔2〕。硫氧還蛋白(TRX)是機(jī)體內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，Mr為12 kD，在體內(nèi)分布廣泛，具有多種生物學(xué)功能〔3〕。研究證實(shí)，硫氧還蛋白參與機(jī)體的氧化還原反應(yīng)，影響細(xì)胞的增殖和生存，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，參與某些組織的應(yīng)激反應(yīng)。近年來(lái)，TRX在心血管系統(tǒng)疾病中的作用也日益受到人們關(guān)注。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)人內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304沒(méi)有硫氧還蛋白的表達(dá)。本文對(duì)TRX基因修飾的ECV304細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，探討TRX其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ECV340(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所)，ECV304/TRX細(xì)胞株系本室構(gòu)建，胎牛血清(杭州四季清)，1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司產(chǎn)品)。丙二醛(MDA)及NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司產(chǎn)品)，ET檢測(cè)試劑盒(華美生物有限公司產(chǎn)品)。

1.2 細(xì)胞分組及缺氧/復(fù)氧模型的建立 將不同內(nèi)皮細(xì)胞分為3組:ECV304/TRX組、pcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組(空載體組)及正常對(duì)照組(ECV304組)，參照文獻(xiàn)〔4〕對(duì)前兩組細(xì)胞進(jìn)行缺氧實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置未缺氧的ECV304細(xì)胞作為對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MDA的影響 ECV304組，其細(xì)胞內(nèi)的MDA含量在24 h內(nèi)變化不大;空載體組，在缺氧3 h時(shí)，MDA含量顯著增加，復(fù)氧12 h時(shí)，MDA含量達(dá)到最高，然后緩慢下降;ECV304/TRX組與空載體組相比，在缺氧3 h及復(fù)氧12 h時(shí)，MDA含量極顯著下降(P＜0.01)，而在24 h MDA水平下降顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧的內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的影響 ECV304組，其細(xì)胞內(nèi)的NO含量在24 h內(nèi)變化不大;空載體組細(xì)胞在缺氧3 h時(shí)，NO含量顯著下降，復(fù)氧12 h時(shí)，NO含量下降到最低，然后緩慢上升;ECV304/TRX組與空載體組相比，在缺氧3 h及復(fù)氧12 h時(shí)，NO含量極顯著上升(P＜0.01)，在12 h時(shí) NO水平最高。ECV304/TRX組與ECV304組相比，在12 h時(shí)，有顯著差異。見(jiàn)表2。

2.3 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧的內(nèi)皮細(xì)胞釋放 ET-1的影響 ECV304組，其細(xì)胞內(nèi)的ET-1含量在24 h內(nèi)變化不大;空載體組，在缺氧3 h，細(xì)胞內(nèi)ET-1含量迅速上升，復(fù)氧12 h時(shí)，ET-1含量上升最高;ECV304/TRX組與空載體組相比，ET-1水平在復(fù)氧的各時(shí)間點(diǎn)均比有下降，在復(fù)氧24 h下降最明顯(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表1 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞MDA的影響(±s，μmol/L)

表1 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞MDA的影響(±s，μmol/L)

與轉(zhuǎn)染空載體組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別0.54±0.02 0.72±0.03 1.03±0.07 1.24±0.10空載體組 0.56±0.04 5.64±0.17 8.38±0.08 3.15±0.07 ECV304/TRX組 0.49±0.05 1.96±0.041)2)3.42±0.031)2.62±0.032)0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組

表2 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的影響(±s，μmol/L)

表2 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的影響(±s，μmol/L)

與空載體組比較:1)P＜0.01;與ECV304組比較:2)P＜0.05

實(shí)驗(yàn)組0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組 54.42±7.55 56.32±7.87 58.13±7.54 62.46±7.21空載體組 51.25±6.23 30.19±5.24 23.40±5.65 35.26±5.44 ECV304/TRX組52.49±8.65 60.96±10.041)75.43±9.531)2)65.82±8.731)

表3 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1的影響(±s，μmol/L)

表3 TRX對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1的影響(±s，μmol/L)

與空載體組及ECV304組比較:1)P＜0.01

實(shí)驗(yàn)組0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組 10.52±2.12 10.42±2.15 10.63±2.09 10.24±2.10空載體組 10.48±2.11 50.56±10.04 56.64±10.17 52.38±9.08 ECV304/TRX組 10.32±2.13 30.49±5.251)25.96±5.441)22.42±4.831)

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋在血管內(nèi)膜表面，具有多種重要的生理功能，參與機(jī)體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等過(guò)程。在缺氧及缺氧復(fù)氧中，內(nèi)皮細(xì)胞是組織中受攻擊的第一靶器官，其中內(nèi)皮源性的舒血管因子和縮血管因子的分泌調(diào)節(jié)功能更是最先受損〔5〕。缺氧/復(fù)氧后活性氧產(chǎn)生可以透過(guò)細(xì)胞膜，在膜外與Fe2+或Cu2+生成羥自由基，從而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)而導(dǎo)致?lián)p傷，羥自由基在缺氧再?gòu)?fù)氧損傷中起核心作用〔6〕。一旦內(nèi)皮細(xì)胞受損，其分泌血管活性物質(zhì)的功能將發(fā)生改變，通過(guò)測(cè)定VECs分泌的血管活性物質(zhì)，可判斷內(nèi)皮細(xì)胞功能，NO就是VECs損傷的敏感的標(biāo)志物〔7〕。當(dāng)ECV中氧自由基過(guò)多時(shí)，其與NO作用，生成一些硝基化合物，使NO減少。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明缺氧損傷內(nèi)皮，使內(nèi)皮依賴性的血管舒縮功能紊亂，而復(fù)氧后進(jìn)一步加重缺氧帶來(lái)的損傷，且缺氧及缺氧復(fù)氧帶來(lái)的損傷至少可持續(xù)至復(fù)氧后12 h，復(fù)氧24 h后內(nèi)皮依賴的血管舒縮活性有所恢復(fù)但未能完全恢復(fù)。

氧自由基大量產(chǎn)生是目前公認(rèn)的缺氧及缺氧復(fù)氧造成細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，除氧自由基外，缺氧及缺氧復(fù)氧還可通過(guò)其他機(jī)制抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO、ET的生成。缺氧及缺氧復(fù)氧可直接作用于(NO)合成的限速酶一氧化氮合酶(NOS)，使其活性下降〔9〕;還引起生成NO的底物 L-精氨酸大量耗竭，使L-精氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，使NO生成減少〔10〕。同樣，缺氧及缺氧復(fù)氧可直接作用于ET基因，使ET轉(zhuǎn)錄增加;缺氧及缺氧復(fù)氧還刺激凝血系統(tǒng)，使凝血酶生成增加，通過(guò)凝血酶刺激 ET 大量生成〔11，12〕。

TRX能升高缺氧-復(fù)氧環(huán)境下ECV中NO的釋放，可能是通過(guò)降低缺氧/復(fù)氧ECV產(chǎn)生氧自由基的量，減少氧自由基對(duì)NO的滅活;同時(shí)，TRX也可能通過(guò)活化NOS，使NO含量顯著升高而抗ECV損傷。

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