姜 虹 朱國(guó)巍 王麗君 (北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院，吉林 吉林 132013)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位〔1〕。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞凋亡失控密切相關(guān)，因此，利用凋亡調(diào)控機(jī)制尋找高效低毒、作用機(jī)制明確的凋亡誘導(dǎo)劑已成為腫瘤防治的一個(gè)重要策略?；诤》肿踊衔锞哂性谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制及其相應(yīng)的細(xì)胞生理功能〔2〕，結(jié)合鈀配合物(PBIPS)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用〔3〕，本文以含硒小分子為配體，設(shè)計(jì)合成了新型含硒生物活性小分子配合物，經(jīng)元素色譜分析、紅外光譜分析等進(jìn)行表征(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)，以乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)為體外模型，研究PBIPS對(duì)MCF-7增殖抑制及其誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的能力，探討其作用的分子機(jī)制，以求為乳腺癌的治療尋求新的有效方法、策略提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 PBIPS由本實(shí)驗(yàn)室制備，MCF-7(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)，RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，碘化丙啶(PI)(美國(guó)Caltag公司)，吖啶橙(A0)/溴乙啶(EB)(華美生物工程有限公司)，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、Bcl-2，survivin、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)抗體(Santa Cruz Biotechnologies公司)。流式細(xì)胞儀(FCM)(美國(guó) Beckman coulter公司)，描定蛋白/碘化丙啶(Annexin/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽公司)，BX51TF熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞均常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1.5×104/孔接種于96孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再加入PBIPS，使每孔的終質(zhì)量濃度分別為0、12.5、25、50、100、150、200 μg/ml(每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè) 5 個(gè)平行孔)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。分24 h、48 h、72 h共3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)棄上清，加入5 mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)試劑10 μl，37℃、5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出加入DMSO 150 μl/孔，充分振蕩10 min溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定每孔的吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率〔4〕。抑制率(%)=〔A(陰性)/A(給藥)〕/〔A(陰性)/A(空白)〕×100%。

圖1 PBIPS結(jié)構(gòu)式

1.2.3 熒光顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為100 μg/ml的 PBIPS 處理，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，分別作用 24 h、48 h、72 h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞懸液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，AO/EB染色后在熒光顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4 FCM檢測(cè)PBIPS對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板中，加入PBIPS使其終濃度分別為 50 μg/ml(低劑量組)、100 μg/ml(中劑量組)、200 μg/ml(高劑量組)，處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，計(jì)數(shù)后取約 5×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用預(yù)冷PBS洗滌2次，按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入 Annexin V-FITC 10 μl和 PI 5 μl，避光室溫反應(yīng)15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以AnnexinⅤ+細(xì)胞比率作為細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，另設(shè)空白對(duì)照組。

1.2.5 Western印跡檢測(cè)PBIPS對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 應(yīng)用Western印跡技術(shù)，以β-actin作為內(nèi)照物，比較各組survivin、Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表達(dá)水平的改變。作用 48 h后分別收集空白對(duì)照組、PBIPS 50、100、200 μg/ml劑量組的細(xì)胞，PBS洗3次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，裂解后離心取上清，用Bradford法測(cè)定各種蛋白的濃度。分別取蛋白樣品，按體積比4∶1加入上樣緩沖液，100℃、5 min變性，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)(5%的濃縮膠，18%的分離膠)電泳分離后，將蛋白電轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜經(jīng)脫脂奶粉封閉液封閉，將硝酸纖維素膜分別加入稀釋后一抗，再用相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗稀釋液孵育，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法檢測(cè)不同樣品各種蛋白表達(dá)狀況。圖像以Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析，用目的蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值與β-actin條帶的平均光強(qiáng)度值的比值表示該蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PBIPS對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，PBIPS可以時(shí)間和劑量依賴性地誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生生長(zhǎng)抑制。12.5～200 μg/ml PBIPS對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，在 24 h、48 h、72 h 的 IC50值分別是 128.7、86.7、60.8 μg/ml。見(jiàn)圖 2。

2.2 AO/EB雙染法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變 PBIPS處理MCF-7細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。對(duì)照組正常細(xì)胞核為結(jié)構(gòu)規(guī)則的綠色染色質(zhì);藥物作用24h時(shí)，部分細(xì)胞核染色質(zhì)著黃色或黃綠色，呈圓珠狀或固縮狀，為早期凋亡細(xì)胞;48 h時(shí)細(xì)胞核染色質(zhì)著橘紅色，呈固縮狀，為晚期凋亡細(xì)胞;72 h時(shí)大部分細(xì)胞核染色質(zhì)著橘紅色，與作用48 h相比增多，并且細(xì)胞發(fā)生壞死，顯示為橙紅色的濃縮、碎裂染色質(zhì)。見(jiàn)圖3。

2.3 PBIPS對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，50、100、200 μg/ml PBIPS作用 MCF-7 細(xì)胞 24 h后即出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，隨著PBIPS濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，呈現(xiàn)明顯的劑量/時(shí)間正向依賴關(guān)系。見(jiàn)圖4，5。

2.4 PBIPS對(duì) MCF-7細(xì)胞 survivin、Caspase-3、bcl-2及 bax蛋白表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)顯示經(jīng)50、100、200 μg/ml PBIPS處理MCF-7細(xì)胞48 h，蛋白條帶相對(duì)強(qiáng)度圖表明，隨著作用濃度的增加，survivin和Bcl-2的蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，而Caspase-3和bax的表達(dá)卻顯著升高，其效應(yīng)均具有濃度梯度依賴性(P＜0.05或P＜0.01)。見(jiàn)圖6。

圖2 MTT檢測(cè)PBIPS對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖3 AO/EB檢測(cè)各組凋亡情況(×200)

圖4 MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同濃度PBIPS處理24 h后凋亡情況

圖5 MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同濃度PBIPS處理后凋亡情況

圖6 PBIPS對(duì)MCF-7細(xì)胞 survivin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示 PBIPS可以時(shí)間和劑量依賴性地抑制MCF-7細(xì)胞體外生長(zhǎng)，其抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程，受多種因素精確地調(diào)控〔5〕。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，對(duì)于凋亡通路起主要調(diào)節(jié)作用的有三類(lèi)蛋白:(1)bcl-2蛋白家族，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體膜的通透性，從而決定細(xì)胞色素c的釋放。本實(shí)驗(yàn)所選用的bcl-2蛋白是抑制細(xì)胞凋亡的基因代表，主要是通過(guò)在線粒體外膜發(fā)揮作用，以維持膜的完整性，從而抑制細(xì)胞色素c的釋放，而bax蛋白是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因代表，其作用是擴(kuò)張線粒體外膜的通透性，使凋亡相關(guān)蛋白如細(xì)胞色素c可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡途徑，細(xì)胞中bcl-2與bax的比例扮演著重要角色，bax/bcl-2比值可以代表細(xì)胞凋亡能力〔6，7〕;(2)Caspase是凋亡機(jī)制的核心成分，擔(dān)任細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行者的角色。Caspase是名副其實(shí)的“破壞者”，它們切斷細(xì)胞與周?chē)穆?lián)系，拆散細(xì)胞骨架，阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制和修復(fù)，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞降解為凋亡小體〔8〕;(3)尿亮氯酸氨基肽酶(IAP)蛋白，主要作用是調(diào)節(jié)Caspase活性。在凋亡信號(hào)刺激下，這三類(lèi)蛋白相互作用，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序〔9〕。

Survivin被認(rèn)為是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中作用最強(qiáng)的凋亡蛋白抑制因子。Survivin的過(guò)度表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡，有利于細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。Caspase-3是Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者之一，與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體的形成有關(guān)，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細(xì)胞凋亡受抑。功能強(qiáng)大的凋亡抑制基因Survivin主要在凋亡通路的下游抑制Caspase-3發(fā)揮抗凋亡的效應(yīng)〔10〕。為此，本文采用Western印跡檢測(cè)了相關(guān)凋亡蛋白Survivin和Caspase-3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Survivin在PBIPS誘導(dǎo)下出現(xiàn)了表達(dá)顯著下調(diào)，而致凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)顯著增加，從而導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞凋亡。

bcl-家族成員的構(gòu)成比例直接決定了線粒體外膜各種通道的開(kāi)放程度，是調(diào)控細(xì)胞凋亡線粒體途徑的關(guān)鍵因素，采用Western印跡檢測(cè)了該家族中具有代表性的凋亡蛋白bcl-2和bax的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PBIPS作用后MCF-7細(xì)胞中抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白bax的表達(dá)顯著上調(diào)，表明MCF-7細(xì)胞凋亡與上述凋亡調(diào)控基因在翻譯水平上的變化有關(guān)。

1 侯 凈，王子良，楊 恭，等.EMSY在乳腺癌中的功能研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)癌癥雜志，2012;22(4):300-7.

2 Zhao R，Xiang N，Domann FE，et al.Expression of p53 enhances seleniteinduced superoxide production and apoptosis in human prostate cancer cells〔J〕.Cancer Res，2006;66(4):2296-304.

3 高恩君，程卯生，王克華，等.鈀配合物抗癌活性研究進(jìn)展〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006;6(2):236-9.

4 張亞宏，郭敬功，郭子華，等.白藜蘆醇通過(guò)激活 p38-p53通路誘導(dǎo)人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞凋亡〔J〕.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011;46(11):1332-7.

5 Daniel JC，Smythe WR.The role of Bcl-2 family members in non-small cell lung cancer〔J〕.Semin Thorac Cardiovasc Surg，2004;16(1):19-27.

6 Levine B，Sinha S，Kroemer G.Bcl-2 family members:dual regulators of apoptosis and autophagy〔J〕.Autophagy，2008;4(5):600-6.

7 Danial NN.Bcl-2 family proteins:critical checkpoints of apoptotic cell death〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(24):7254-63.

8 Ming Sun，Yumei Zhao，Yi Gu，et al.Inhibition of nNos reduces ischemic cell death through down-regulating calpain and caspase-3 after experimental stroke〔J〕.Neurochem Int，2009;54(5-6):339-46.

9 Hunter AM，LaCasse EC，Korneluk RG，et al.The inhibitors of apoptosis(IAPs)as cancer targets〔J〕.Apoptosis，2007;12(9):1543-68.

10 Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and 7〔J〕.Biochemistry，2001;40(4):1117-23.