王國媛 吳明華 韓 漾 梁 森 馬 立 吳顥昕 (南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 20009)

腦梗死屬于缺血性腦血管疾病，約占全部腦血管意外的60% ～80%〔1〕，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點。我國腦卒中年發(fā)病率為(109.7～217)/10萬，死亡率為(116～141.8)/10萬，居于城市致死疾病之首位〔2〕;幸存者中也有近四分之三患者留有嚴重后遺癥，給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)。天麻通腦顆粒(組方:天麻、鉤藤、石斛、川芎、赤芍、制南星、天竺黃、僵蠶、地龍、水蛭)，以經(jīng)典方劑天麻鉤藤飲和通竅活血湯化裁加減而成;具有平肝息風(fēng)與活血化痰共治作用，使痰化而血行、血行則痰清，氣血流暢，以達治療之效〔3〕。本次研究旨在觀察天麻通腦顆粒對缺血性腦卒中大鼠行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)的變化，探討其對大腦中動脈梗死大鼠的缺血性腦卒中后神經(jīng)血管再生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 天麻通腦顆粒(江蘇省中醫(yī)院提供)，5-溴脫氧尿核苷(BrdU，Sigma公司，美國)，過氧化物酶結(jié)合的抗生物素蛋白鏈菌素(1∶500，Jackson公司，美國)，小鼠單克隆BrdU一抗(1∶800，Sigma公司，美國)，生物素化的羊抗鼠 BrdU二抗(1∶500，Jackson 公司，美國)，顯色劑 DAB(Sigma 公司，美國)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51，日本)。

1.2 動物模型的制作與分組 健康成年雄性SD大鼠54只，體重280～330 g(南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)。隨機分為假手術(shù)組(n=18)和模型組(n=36)。參照《現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法》〔4〕中所記載的線栓法制作大鼠大腦中動脈局灶性缺血再灌注(MCAO)模型和Zea Longa等〔5～7〕的方法。模型組以10%水合氯醛(350 mg/kg，ip)麻醉大鼠，不宜一次性進行深度麻醉，先給予標準用量之最小量，術(shù)中如有清醒跡象以≤0.1 ml的用量逐次增加，術(shù)后可較快清醒并出現(xiàn)自主運動。大鼠仰臥位固定，取頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織、右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及各動脈分支。手術(shù)過程中注意避免刺激氣管和神經(jīng)，減少手術(shù)出血。頸外動脈下遠端穿線，結(jié)扎后將動脈在兩線間剪斷。用無損傷動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈。將一頭端燒成梭狀的釣魚線(直徑約0.23～0.26 mm)插入頸外動脈，穿過其與頸內(nèi)動脈的相交處進入頸內(nèi)動脈。去除頸內(nèi)動脈夾的同時繼續(xù)將線插入到顱內(nèi)段，插線長度自頸內(nèi)動脈起始部算起約為16～18 mm。除去動脈夾，縫合頸部傷口，插線的末端固定于切口外。大約90 min～2 h后將線輕輕抽出進行再灌注。術(shù)后實驗大鼠完全清醒并開始自主運動時，以出現(xiàn)追尾反應(yīng)，即向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈運動;或大鼠提尾狀態(tài)下，缺血對側(cè)出現(xiàn)前肢向內(nèi)屈收為陽性反應(yīng)，證明造模成功。假手術(shù)組不做頸內(nèi)動脈置線，其余步驟基本相同。將MCAO模型組大鼠于術(shù)后隨機分為模型對照組和給藥組每組18只，經(jīng)24 h后分別通過灌胃給藥法給予等量等滲生理鹽水或天麻通腦顆粒，4 ml/次，2次/d;假手術(shù)組灌胃給藥法給予等量等滲生理鹽水4 ml/次，2次/d，共14 d。于開始給藥后第10、11、12天腹腔注射溶于等滲鹽水中配制成1%的BrdU溶液，50 mg/kg，1 次/8 h，2 次/d。

1.3 主要檢測指標

1.3.1 神經(jīng)功能測定 參照《現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法》〔4〕采用神經(jīng)功能缺損評分標準(NSS)，每組隨機抽取6只，均設(shè)4個時間點，于術(shù)后2 h、1 d、7 d、14 d進行評價。無任何異常行為，0分;提起鼠尾，健側(cè)前肢內(nèi)旋、肩內(nèi)收為損傷較輕，1分;上述癥狀基礎(chǔ)上，置于光滑平面，向健側(cè)推擋時阻力減弱或動物轉(zhuǎn)圈追尾爬行，為中度損傷，2分;提起鼠尾，向患側(cè)旋轉(zhuǎn)，損傷較嚴重，3分;動物處于精神抑制狀態(tài)，不能進行自發(fā)活動，4分。

1.3.2 梗死灶體積的測定 MCAO后經(jīng)連續(xù)給藥14 d，每只大鼠以4%多聚甲醛進行心臟灌注，后斷頭取腦，4%多聚甲醛中固定約24 h后，冰凍切片機上切取大腦中動脈周圍腦組織冠狀切片，片厚16～20 μm，各取5～7片，間隔約2 mm，采用蘇木素伊紅染色法，評價梗死灶體積〔8〕。梗死體積用其占未缺血側(cè)半球的百分數(shù)表示。

1.3.3 BrdU免疫組化檢測 MCAO術(shù)后給藥14 d，大鼠深度麻醉后，先以250 ml生理鹽水快速沖洗左心室，再用4%多聚甲醛心臟灌注后立刻斷頭取腦;腦組織置于固定液中保存，每次使用前于30%蔗糖溶液中脫水過夜。冰凍切片機上進行連續(xù)冰凍切片(片厚10～13 μm);將切片置于50%甲酰胺2×SSC緩沖液(pH7.0)中60℃溫水浴2 h，再置于2 mol/L鹽酸溶液中37℃溫水浴30 min，促使其DNA變性;3%H2O2反應(yīng)約5～10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;5% ～10%牛血清白蛋白(PBS稀釋后)室溫下封閉30 min;去血清后不洗，直接加入稀釋后一抗(約50 μl)，溫箱37℃ 1～2 h或4℃過夜;PBS漂洗后加二抗室溫孵育2 h;DAB顯色5～10 min左右，鏡下控制并即時終止顯色;水洗3 min后，復(fù)染，常規(guī)樹脂封片;陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色〔9〕;200倍光鏡下對每張切片缺血側(cè)室管膜下區(qū)(SVZ)及紋狀體進行BrdU陽性細胞計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 模型對照組大鼠于術(shù)后2 h和第1天神經(jīng)功能損傷情況嚴重，之后有自發(fā)恢復(fù)的趨勢。給藥組大鼠的神經(jīng)功能與模型對照組比較已有顯著恢復(fù)，并隨時間推移其治療效果越明顯。術(shù)后2 h、1 d、7 d、14 d，模型對照組評分分別為2.6±0.5、2.7±0.5、1.8±0.4、1.7±0.5;給藥組分別為2.6±0.5、2.5±0.5、1.5±0.6、0.8±0.4(P 值分別為1.000、0.448、0.043、0.031)。由此可見天麻通腦顆粒的干預(yù)顯示出的正性作用。假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2 梗死灶體積測定 術(shù)后14 d，模型對照組以大片狀居多，缺血梗死嚴重，隨切片深入有加重趨勢;給藥組以分散狀為主，缺血梗死較輕，隨切片深入有分散均勻且逐漸減輕的趨勢。模型對照組與給藥組梗死灶體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)。假手術(shù)組大鼠無梗死灶。模型對照組缺血梗死嚴重且大片狀居多，隨切片深入有加重趨勢;給藥組則缺血梗死較輕多以分散狀為主，隨切片深入有減輕的趨勢。見表1和圖1。

2.3 BrdU陽性細胞 假手術(shù)組中只限于SVZ區(qū)出現(xiàn)少量BrdU陽性細胞，紋狀體區(qū)并未見陽性細胞。模型對照組陽性細胞數(shù)量較少、分布零散;而給藥組經(jīng)術(shù)后14 d給藥后，SVZ及紋狀體的陽性細胞數(shù)量較模型對照組有顯著增加(P＜0.05)，且細胞核深染、排列緊湊。見表1和圖2。

圖1 模型對照組與給藥組不同視角梗死灶體積表達(蘇木素伊紅染色，×400)

表1 各組大鼠腦梗死后14 d梗死灶體積及BrdU陽性細胞數(shù)(n=6，±s)

表1 各組大鼠腦梗死后14 d梗死灶體積及BrdU陽性細胞數(shù)(n=6，±s)

1)給藥組與模型對照組比較

組別 梗死灶體積(%)BrdU陽性細胞數(shù)SVZ 0±0 37.3±16.7 0±0模型對照組 46.8±12.8 196.3±35.8 222.3±35.3給藥組 19.5±9.1 317.9±53.8 330.8±55.1 P值1)缺血側(cè)紋狀體假手術(shù)組0.044 0.009 0.040

圖2 模型對照組與給藥組不同腦區(qū)BrdU陽性細胞表達(免疫組化染色)

3 討論

腦梗死屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，中醫(yī)學(xué)將其歸于“中風(fēng)”、“偏枯”、“類中”、“卒中”等范疇，多因臟腑功能失調(diào)，元氣耗傷，憂思惱怒等使瘀血阻滯，痰熱內(nèi)蘊，陽化風(fēng)動，血隨氣逆而上犯于腦，終致腦脈瘀滯所致〔10〕。本研究所討論的是缺血性腦卒中，其病因病機復(fù)雜多變，臨床上亦無法單以一種觀點把握疾病整體的變化轉(zhuǎn)歸?！吨酗L(fēng)病辨證診斷標準》〔11〕確立的病理因素有風(fēng)、火、痰、瘀、氣虛、陰虛陽亢六種，瘀血與痰濁是缺血性腦卒中的主要致病因素和病理產(chǎn)物?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》曰“孫絡(luò)水溢，則經(jīng)有留血”。《醫(yī)方考》曰:“中風(fēng)，手足不用，日久不愈者，經(jīng)絡(luò)中有濕痰死血也?！碧迫荽ā堆C論》曰:“痰水日久，亦能化為瘀血”，“須知痰水之壅皆為瘀血使然，但去瘀血則痰水自消”。在腦卒中急性期風(fēng)、火、痰邪為主要病因，隨著疾病的發(fā)展風(fēng)漸停、火漸熄，終成痰瘀阻絡(luò)為患，二者既可單獨出現(xiàn)于疾病過程中，又經(jīng)常相兼致病、貫穿始終，是缺血性中風(fēng)急性期的重要病因和基本病機。

中醫(yī)中藥治療腦梗死一直有其獨特的優(yōu)勢，常用的治則治法有清熱解毒法、化痰通腑法、平肝熄風(fēng)法、活血化瘀法、醒腦開竅法等。根據(jù)疾病急性期的病理變化，早期予以平肝熄風(fēng)、清熱瀉火是很重要的，及至轉(zhuǎn)為痰阻血瘀，再以活血通瘀化痰之法治療。本研究以天麻通腦顆粒選天麻鉤藤飲和通竅活血湯加減化裁而成，共奏平肝熄風(fēng)、活血化瘀之效〔3〕。此方以川芎、赤芍二藥為君，均有活血化瘀之效;天麻、鉤藤平肝熄風(fēng)，制南星、天竺黃清熱燥濕化痰，共為臣要;佐以僵蠶、地龍及水蛭，蟲類藥善動入絡(luò)，可搜剔經(jīng)脈，增強清熱熄風(fēng)之功效。旨在平肝熄風(fēng)與活血化痰共治，使痰化而血行、血行則痰清，氣血流暢，以達治療之效。

現(xiàn)代藥理研究表明，川芎、赤芍類活血藥能降低血小板活性、抑制其聚集從而促進血液循環(huán);天麻、鉤藤可擴張腦動脈和冠狀動脈，使血流量增加;制南星等化痰藥有降脂作用〔3〕;地龍可抗栓溶栓，抗凝血的同時又不影響止血，用于腦梗死的治療取得一定的療效〔12〕;水蛭可抗凝血、抗血栓之用，同時可減少腦梗死后炎性因子的產(chǎn)生，減輕炎性反應(yīng)，推遲腦細胞的凋亡并改善局部血液循環(huán)，從而對缺血腦細胞起到保護作用〔13〕。本研究表明天麻通腦顆?？梢源龠M腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)并對缺血后腦細胞的增殖具有一定療效。

1 張國瑾，趙增榮.國外腦血管疾病研究進展〔M〕.北京:中醫(yī)醫(yī)藥科技出版社，2001:21.

2 粟秀初.現(xiàn)代腦血管病學(xué)〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社，2003:117.

3 江淑婷，吳明華.天麻通腦飲治療急性腦梗塞痰瘀阻絡(luò)證的臨床療效觀察〔J〕.疑難病雜志，2011;5(10):328-30.

4 吳俊芳，劉 忞.現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法〔M〕.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2006:809-61.

5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

6 Garcia TH.A reliable method to occlude a middle cerebral in wistar rats〔J〕.Stroke，1993;24(9):1423.

7 Zarow GJ，Karike H，States BA，et al.Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats:effect of suture insertion distance on cerebral blood flow infarct distribution and infarct volume〔J〕.Neurol Res，1997;24(9):409-16.

8 王兆露，殷 勤，成松明，等.經(jīng)鼻給予堿性成纖維細胞生長因子治療大鼠腦梗死的研究〔J〕.中國腦血管病雜志，2008;5(10):451-5.

9 王伯沄，王文勇.免疫細胞(組織)化學(xué)和分子病理學(xué)技術(shù)〔M〕.西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2010:31-61.

10 潘國慶，羅清平.腦梗死中醫(yī)治療方法綜述〔J〕.長沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院院報，2008;15(1):107.

11 國家中醫(yī)藥管理局腦病急癥科研組.中風(fēng)病辨證診斷標準(試行)〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1994;17(93):64-5.

12 劉秀艷.地龍的藥理研究〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2008;35(1):106-7.

13 袁繼偉，焦躍軍，李晶堯.中藥水蛭的藥理藥效研究〔J〕.中國醫(yī)療前沿，2009;4(18):18.