姜梅玲 劉玉龍 李 元 卞華慧 陳煒博 王優(yōu)優(yōu) 張 英 孔雪源

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215004)

化療為中晚期結(jié)直腸癌的主要治療方法，化療的主要藥物為氟尿嘧啶類、喜樹堿衍生物類、鉑類及分子靶向類藥物。相關(guān)研究表明〔1～4〕，TS、TOPO-I、ERCC1 蛋白表達(dá)情況可以預(yù)測化療藥物的療效及毒副反應(yīng)，化療前通過檢測TS、TOPO-I、ERCC1蛋白或基因多態(tài)性的表達(dá)，制定合理的化療方案，有利于提高治療的療效，延長患者生存期，提高生活質(zhì)量。本研究檢測了結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達(dá)情況，并探討其與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本取自術(shù)后腫瘤組織的石蠟塊或活檢后甲醛溶液固定組織。均經(jīng)病理診斷證實。術(shù)前或活檢前未行任何放、化療。

1.2 臨床資料 2011年1月至2012年7月在我院住院的111例結(jié)直腸癌患者中男性61例，女性50例;年齡28～81歲，中位年齡54.5歲;結(jié)腸癌52例，直腸癌59例;T分期:T1+T2 14例，T3+T4 97例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:N0 10例，N1 73例，N2 28例;腫瘤分化程度:高分化10例，中分化76例，低分化24例，未分化1例。

1.3 實驗試劑 S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。TS抗體(稀釋比例:1∶100)購自福建邁新公司。TOPO-I、ERCC1抗體(稀釋比例:1∶100)購自北京中衫公司。

1.4 實驗方法 免疫組化染色法采用SP法檢測TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達(dá)。常規(guī)脫蠟、乙醇梯度水化，枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，37℃ 10 min，滴加一抗(TS、TOPO-I、ERCC1，1∶50)，4℃過夜，滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，后再滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，DAB顯色3～10 min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明。中性樹膠封片后鏡下觀察，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性片做陽性對照。

1.5 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由2名未參與實驗研究、不了解患者臨床資料的病理醫(yī)生分別獨立觀察所有切片。遇結(jié)果不一致時，由2人協(xié)商決定。以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核膜出現(xiàn)棕紅色顆粒為陽性，隨機取5個高倍視野，TS、ERCC1按細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)顯色深淺計分，無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺紅色為1分，棕紅色為2分，棕褐色為3分。0～1分判斷為低表達(dá)(+)，2分判斷為中表達(dá)(?)，3分判斷為高表達(dá)(?)。TOPO-I按細(xì)胞核著色程度評判，＜10%為低表達(dá)，10% ～50%為中表達(dá)，＞50%為高表達(dá)。

1.6 近期療效和生存評價 在完成3個周期FOLFOX或FOLFIRI方案化療后，進行胸部、腹部和盆腔CT或MRI檢查。按實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)評價近期療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD);其中，CR和PR病例數(shù)之和為治療有效病例，有效率(RR)為治療有效病例數(shù)占全部病例數(shù)的百分比。計算無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)，PFS是指從一線化療開始至PD或死亡的時間，OS是指從一線化療開始至死亡或末次隨訪的時間。隨訪方式為門診或電話隨訪，末次隨訪時間為2012年7月1日。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 腫瘤組織中TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性均采用χ2檢驗分析。所有統(tǒng)計分析由SPSS17.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 TS、TOPO-I、ERCC1在111例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的表達(dá) TS、ERCC1表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，TOPO-I表達(dá)主要集中在細(xì)胞核中。見圖1。

2.2 TS、TOPO-I、ERCC1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性 TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及分化程度等臨床病理特征均無明顯差異性(P＞0.05)。見表1。

2.3 療效及生存評價 根據(jù)NCCN指南中提出的結(jié)直腸癌化療的適應(yīng)證和建議的化療方案及聯(lián)合ERCC1的檢測結(jié)果，對50例患者采用了FOLFOX方案化療?？紤]患者檢測的時間不一致，只對其中40例患者進行10～14個月的療效及預(yù)后隨訪，即中位隨訪時間為1年。結(jié)果提示:CR 5例(12.5%)，PR 16例(40.0%)，PD 14例(35.0%)，SD 5例(12.5%)，有效率為52.5%。PFS最少為3個月，最長者未知;在這一年的隨訪中無死亡病例，OS需要繼續(xù)隨訪觀察。TOPO-I在111例結(jié)直腸癌腫瘤組織中，近50例患者TOPO-I為高表達(dá)，根據(jù)檢測結(jié)果對39例患者行FOLIFRI方案化療，后對其中30例患者進行療效及預(yù)后隨訪。結(jié)果提示:CR2例(6.7%)，PR10例(33.3%)，PD6例(20.0%)，SD2例(6.7%)，有效率為 40%。PFS最少為5個月，最長者未知;在這一年的隨訪中無死亡病例，OS需要繼續(xù)隨訪觀察;在化療過程中及化療后患者的不良反應(yīng)較輕。

圖1 TS、TOPO-Ⅰ、ERCC1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(DAB，×400)

表1 TS、TOPO-I、ERCC1陽性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

近年來腫瘤的治療取得了相當(dāng)大的進展，但在不同種族人群或個體間仍存在顯著的治療敏感性和不良反應(yīng)之間的差異。這主要與腫瘤本身的生物學(xué)特性有關(guān)。目前常用抗腫瘤化療藥物的有效性不僅低于70%，而且由于缺乏化療藥物個體化治療的遺傳學(xué)分析，使20%～40%的患者甚至有可能接受了錯誤的藥物治療，同樣病理類型、病理分期甚至分子表型相同的患者，在接受相同方案治療后可能產(chǎn)生“天壤之別”的結(jié)果〔5〕。

腫瘤的個體化治療正是為了改變這種傳統(tǒng)的治療模式，提高腫瘤的治療效果而產(chǎn)生的。所謂腫瘤的個體化治療〔6〕，即醫(yī)生根據(jù)患者具體情況通過相關(guān)檢測與分析，判斷患者對哪種治療敏感，選擇合理的治療方案，以縮短治療時間，減輕毒副反應(yīng)，延長生命，提高生活質(zhì)量，達(dá)到滿意的治療效果。近年來，遺傳學(xué)、基因組學(xué)、分子生物學(xué)和抗腫瘤藥物作用機制等方面的研究均取得了突破性的進展，結(jié)直腸癌的個體化治療也開始從理想走向現(xiàn)實。通過檢測相關(guān)基因以預(yù)測抗腫瘤藥物的療效，從而為不同患者選擇最合適的治療方案，已成為提高結(jié)直腸癌治療療效以及減少不良反應(yīng)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)的必經(jīng)之路。在我們的研究中，對TS、TOPO-I、ERCC1的表達(dá)情況進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，結(jié)合美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南中國版中建議的化療方案及醫(yī)師臨床經(jīng)驗，選擇合理的化療方案，爭取達(dá)到滿意的療效。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為抗代謝類抗腫瘤藥物，是胃腸道腫瘤的基礎(chǔ)用藥之一。5-Fu本身并無生物學(xué)活性，在體內(nèi)，須經(jīng)合成代謝轉(zhuǎn)化為核苷酸類似物，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用〔7〕:主要是在胸苷磷酸化酶(TP)催化下，轉(zhuǎn)化為一磷酸脫氧核糖氟尿嘧啶核苷(FdUMP)，后者與TS、亞甲基四氫葉酸形成三聯(lián)復(fù)合物，抑制TS活性，阻礙脫氧胸苷酸(dTMP)從頭合成，繼而干擾DNA復(fù)制。TS酶〔8〕是處于增殖期的細(xì)胞內(nèi)必需蛋白質(zhì)，它的功能是催化尿嘧啶脫氧核苷甲基化為胸腺嘧啶脫氧核苷，是DNA生物合成反應(yīng)中的關(guān)鍵酶〔9〕，所以抑制TS就能達(dá)到抑制DNA生物合成的目的，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。TS酶作為5-Fu類藥物的靶向酶，多項研究已證實〔2〕，其在腫瘤中的蛋白表達(dá)及其基因多態(tài)性與5-Fu的療效相關(guān)，腫瘤組織中TS低表達(dá)，5-Fu類藥物療效較好，患者總生存期延長;TS高表達(dá)，預(yù)示5-Fu類藥物耐藥〔10〕。有關(guān)研究表明〔11〕，TS 蛋白低表達(dá)與TS等位基因的低表達(dá)均提示對氟尿嘧啶類藥物敏感，兩者無明顯的差異性。在本研究中，因患者經(jīng)濟的緣故，我們只檢測了TS蛋白的表達(dá)，未行TS基因多態(tài)性的進一步檢測。

2011 NCCN指南(中國版)結(jié)直腸癌化療方案中提出:FOLFOX或FOLIFRI±西妥昔單抗或帕尼單抗(僅KRAS野生型)，F(xiàn)OLFOX或FOLIFRI±貝伐珠單抗，可用于一線或二線化療。本研究的結(jié)果提示，TS在腫瘤組織中70.3%的患者為低表達(dá)，即近77例患者對氟尿嘧啶類藥物敏感。綜合我們的療效觀察結(jié)果，初步可認(rèn)為較傳統(tǒng)的經(jīng)驗化療療效好，進一步的證實有待我們繼續(xù)統(tǒng)計分析。

對于氟尿嘧啶的衍生物如替吉奧〔12〕，其主要成分替加氟經(jīng)過肝臟代謝成5-Fu，進一步發(fā)揮抗腫瘤作用，在晚期不能耐受靜脈用藥的結(jié)直腸癌或老年性結(jié)直腸癌患者中，也取得較好的療效。TS低表達(dá)的患者，應(yīng)用替吉奧或許會取得較好的治療效果，有待我們進一步的研究。喜樹堿衍生物類化療藥物如伊立替康，是TOPO-I的抑制劑〔13〕，其活性代謝產(chǎn)物SN-38與TOPO-I復(fù)合物結(jié)合，阻止DNA斷裂單鏈的再鏈接。TOPO-I〔14〕是細(xì)胞復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反應(yīng)、修復(fù)過程中的重要酶，通過在DNA的核糖-磷酸主鏈上產(chǎn)生一過性的斷裂而改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，解開DNA纏繞，并在另一DNA鏈從缺口處穿過時，再通過逆向的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)恢復(fù)DNA的完整性。在腫瘤細(xì)胞中，TOPO-I含量及活性遠(yuǎn)高于正常體細(xì)胞〔15〕，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性就可能抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖，進而殺死腫瘤細(xì)胞。相關(guān)文獻指出〔3，16〕，TOPO-I有可能作為預(yù)測伊立替康療效的分子標(biāo)記物，TOPO-I低表達(dá)的患者對伊立替康耐藥，高表達(dá)者敏感。綜合我們的療效觀察結(jié)果，初步可認(rèn)為較傳統(tǒng)的經(jīng)驗化療療效好，更準(zhǔn)確的分析結(jié)果有待我們進一步隨訪觀察。

鉑類藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用主要通過與細(xì)胞內(nèi)親核的DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物。導(dǎo)致DNA的鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián)，引起DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而機體的損傷修復(fù)系統(tǒng)可以修復(fù)這類損傷，從而影響鉑類藥物的化療敏感性〔17〕。核苷酸切除修復(fù)(NER)是人體DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的重要組成部分，鉑類藥物引起的DNA損傷修復(fù)主要由這個系統(tǒng)完成〔18〕。ERCC1在NER途徑發(fā)揮重要作用，影響腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性〔19〕。多項研究表明〔4〕，在腫瘤組織 ERCC1呈低表達(dá)的患者對鉑類藥物敏感，高表達(dá)者耐藥。

NCCN指南中推薦的FOLFOX、FOLIFRI及CapeOx方案中，均包含三代鉑類藥物，若奧沙利鉑耐藥，該三種化療方案可能不會取得預(yù)期的臨床療效。在111例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，近77例患者(70%)ERCC1為低表達(dá)，提示對鉑類藥物敏感。如前所述，臨床醫(yī)生已經(jīng)對50例患者采用了FOLFOX方案化療，并對40例患者進行治療后的療效隨訪，療效較好。

本研究中，根據(jù)衛(wèi)生部結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010年版)中提出的結(jié)直腸癌化療的適應(yīng)證，111例結(jié)直腸癌患者中有89例可行輔助化療，其中結(jié)腸癌患者有42例，直腸癌患者有47例。我院腫瘤科醫(yī)生根據(jù)本研究的檢測結(jié)果，結(jié)合NCCN指南中推薦的化療方案，已經(jīng)對70例患者采用不同的化療方案，并進行化療后的隨訪及觀察，初步認(rèn)為療效較好，毒副反應(yīng)較輕。

本研究結(jié)果表明，TS、TOPO-I、ERCC1三者在腫瘤患者中的表達(dá)情況與臨床病理特征無明顯相關(guān)性，是由腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)特性決定的。對于TS、ERCC1低表達(dá)，TOPO-I高表達(dá)的患者采用相關(guān)敏感的化療藥物治療后，并進行了一年左右的療效隨訪，發(fā)現(xiàn)一部分患者化療后的效果較傳統(tǒng)經(jīng)驗的好，且毒副反應(yīng)減輕。本研究將繼續(xù)進行臨床療效的跟蹤，其中有一部分患者的化療療效仍不理想。一方面，腫瘤的生長是受多基因調(diào)控的，檢測某個基因或某幾個基因并不能反映腫瘤的真實全貌;另一方面，臨床給藥劑量、途徑及方法都可影響化療藥物的療效。TS、TOPO-I、ERCC1三者聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌化療方案的制訂及藥物的選擇意義重大，為開展個體化治療提供依據(jù)。要真正實現(xiàn)腫瘤個體化治療，我們還有很長的路要走。

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