趙書元，吳李鳴

（1.河南省駐馬店市中心醫(yī)院放射科 463000；2.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，杭州310003）

中國的原發(fā)性肝癌病例約占全世界病例的42.5%，且一半以上的患者合并有不同程度的肝硬化與乙型肝炎［1］。對于失去外科手術(shù)機會的患者，臨床上常對其使用肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）進行治療，近年來TACE得到了廣泛的普及，明顯改善了患者的預(yù)后，提高了患者的生活質(zhì)量［2－3］。但單純的化療栓塞術(shù)常常無法達到最佳的治療效果，殘存的肝癌細胞造成了后期的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，影響了整個治療的遠期效果。全反式維甲酸是維生素A的衍生物，也是一類十分重要的誘導(dǎo)分化劑，實驗表明其能夠使得P53與Fas等癌細胞凋亡相關(guān)基因的表達增高，并對 Bcl－2形成抑制作用［4］。而干擾素－α（IFN－α）對于惡性腫瘤在體內(nèi)的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移也有著一定的抑制作用，本研究探討介入圍手術(shù)期IFN－α聯(lián)合全反式維甲酸（ATRA）治療肝細胞癌的療效，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2只5周齡的BALB／c雄性裸小鼠［中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證編號：SCXY（京）－2012－0004］，在IVC環(huán)境中對其進行飼養(yǎng)，所有飼料與飲水均無菌，飼養(yǎng)環(huán)境無病原體。將肝癌細胞CBRH7919的細胞懸濁液接種于裸鼠皮下，每只所接種的細胞數(shù)為1×107。14d后，將接種肝癌細胞的裸鼠處死，取出瘤體組織。將瘤體切成長寬厚分別為2、2、1mm的小瘤塊，并接種于28只Wistar大鼠（購自復(fù)旦大學醫(yī)學院實驗動物科學部）。將所有Wistar大鼠按隨機數(shù)法隨機分為實驗組與對照組，各14只。實驗組雄、雌各7只，平均（182.9±37.2）g；對照組雄、雌各7只，平均（183.7±36.6）g。兩組大鼠的性別及體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 大鼠在接受瘤體移植1個月后，將所有大鼠的肝動脈進行結(jié)扎。實驗組接受IFN－α（1 000U／g，2日／次）與ATRA（0.02mg／g，1日／次）腹腔注射，對照組接受相同劑量的生理鹽水腹腔注射。10d后，取大鼠的下腔靜脈血1mL，于37℃的環(huán)境下放置5h，將標本放入離心機進行離心5min（3 000r／min），分離血清后將其放置于－80℃的冰箱中保存。將所有Wistar大鼠處死，分離腫瘤組織，將標本放置于－80℃的冰箱中保存。測定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的mRNA的表達水平時，將腫瘤組織取出，稱質(zhì)量，將液氮加入研缽，在將標本磨勻后加入1mL TRIzol，混勻后加入到Eppendorf管中并加入氯仿，振蕩混勻后放入離心機離心15min（4℃，12 000r／min）。吸取上清液后將其置于另一個Eppendorf管，加入相同體積的異丙醇后混勻，再次離心10min（4℃，12 000r／min）。離心完畢后將上清液吸除，將濃度為75%的乙醇加入以對剩余的沉淀物進行清洗，離心后將后加入的乙醇棄除。待沉淀干燥后加入DEPC水，形成RNA溶液，采用核酸－蛋白檢測儀檢測RNA濃度，并配置瓊脂凝膠電泳對RNA的完整性進行驗證。VEGF與bFGF蛋白的表達水平及腫瘤微血管密度采用免疫組織化學法進行檢測，外周血的VEGF水平采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測，腫瘤細胞的凋亡指數(shù)采取流式細胞儀及TUNEL進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)間計量資料使用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細胞凋亡指數(shù)比較 實驗組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細胞凋亡指數(shù)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測bFGF及VEGF mRNA表達水平情況比較 實驗組RT－PCR檢測的bFGF及VEGF mRNA表達水平要明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1、2。

2.3 兩組免疫組織化學法檢測的bFGF及VEGF蛋白表達比較 實驗組與對照組免疫組織化學法檢測的bFGF及VEGF蛋白表達結(jié)果與RT－PCR檢測的結(jié)果一致，實驗組上述兩種蛋白的表達均低于對照組，見圖3。

表1 兩組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表1 兩組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細胞凋亡指數(shù)比較（±s）

組別 n VEGF（pg／mL）腫瘤微血管密度（個／HP）腫瘤細胞凋亡指數(shù)（%）14 91.8±12.7 115.7±11.8 12.29±4.53對照組 14 67.4±18.3 65.3±7.2 3.81±1.52 t 4.099 13.642 6.640 P實驗組0.000 0.000 0.000

圖1 兩組RT－PCR檢測bFGF mRNA的表達情況

圖2 兩組RT－PCR檢測VEGF mRNA的表達情況

圖3 免疫組織化學法檢測的bFGF及VEGF蛋白表達

3 討 論

原發(fā)性肝細胞癌的病情進展快且隱匿性強，臨床上手術(shù)切除率不足1／3，TACE的出現(xiàn)使得無法手術(shù)的患者獲得了一種新的治療機會［5－6］。但通過對肝癌患者術(shù)后的病情進行監(jiān)測，許多學者都發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的癌基因Bcl－2的表達在術(shù)后發(fā)生上調(diào)，其對肝癌細胞的誘導(dǎo)程度增強，患者的遠期預(yù)后也因此受到影響。TACE術(shù)后雖然腫瘤的部分血管被栓塞，但腫瘤在缺氧的情況下生成了較多的側(cè)支循環(huán)，殘留的癌細胞造成了癌癥的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移［7］。

VEGF與bFGF是惡性腫瘤細胞所分泌的數(shù)十種生長因子中作用最為重要的兩種因子，其誘發(fā)了內(nèi)皮細胞的增殖與遷移［8］。VEGF在乳腺癌、肺癌、大腸癌及胃癌等惡性腫瘤中的表達與腫瘤微血管的密度關(guān)系緊密，且對于患者的遠期預(yù)后有著一定的預(yù)測價值。本研究結(jié)果顯示，實驗組VEGF與bFGF的表達要顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。腫瘤內(nèi)部微血管的生成過程十分復(fù)雜，主要包括細胞外基質(zhì)與基底膜發(fā)生降解，細胞外基質(zhì)的增殖，新生血管腔的形成并相互吻合成網(wǎng)［9］。在整個過程中，血管生成因子與抑制因子相互協(xié)調(diào)，血管生成的減少與血管生成因子水平的下降直接相關(guān)。VEGF是一種極為重要的血管生成因子，其作為一種特異的內(nèi)皮細胞分裂源能夠大大增加血管的通透性，目前已有許多研究的結(jié)果證明VEGF水平的高低是惡性腫瘤患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素［10］。IFN－α能夠?qū)FGF的表達形成抑制作用，從而對新生腫瘤血管起到抵抗的效果，其機制主要是血管內(nèi)皮細胞在IFN－α的作用下對血管生成因子的敏感性降低。ATRA的生物學活性主要是由細胞核內(nèi)部的視黃素X受體與維甲酸受體所介導(dǎo)，其能夠使P53與Fas等抑癌基因的表達增加，并使得Bcl－2的表達受到抑制，最終誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡或分化。除自身所具備的生物學活性之外，ATRA還能夠?qū)ρ苌梢蜃拥幕钚云鸬矫黠@抑制的作用。體外實驗表明，即使在視黃素的濃度處于中等或以下時，ATRA仍能夠?qū)EGF、bFGF等血管生成因子的表達起到較為明顯的抑制作用［11］。另一方面，ATRA還能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細胞的遷移及層粘連蛋白、膠原等細胞外基質(zhì)的代謝起到抑制的作用。將ATRA與IFN－α聯(lián)合起來在介入圍手術(shù)期配合化療栓塞術(shù)，能夠充分起到栓塞壞死、化療殺傷、分化誘導(dǎo)的作用［12－15］。作為多血管惡性腫瘤，通過對新生血管的抑制能夠在根本上對腫瘤的生長及進一步的轉(zhuǎn)移起到及有意義的干預(yù)。

綜上所述，介入圍手術(shù)期IFN－α聯(lián)合ATRA的使用能夠抑制新生腫瘤血管的生成，提高介入手術(shù)的臨床療效。

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