譚 微，陳小蘭，王楚瓊，姜 泊，何繼滿

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州510515）

生長激素（GH）在機(jī)體的生長、發(fā)育、代謝和衰老等生命過程中起著重要作用；其靶器官包括肝臟、肺、腎臟、肌肉、骨骼等，其中肝臟是GH最重要的靶器官［1－2］。GH已廣泛應(yīng)用于臨床，不再僅僅用于生長激素缺乏的治療，新的應(yīng)用已經(jīng)推廣到治療人類免疫缺陷病毒（HIV）相關(guān)的消耗綜合征和脂肪再分布綜合征、胱氨酸蓄積癥、炎癥性疾病如炎癥性腸?。↖BD）、慢性腎臟疾病等［3－6］。然而，長期應(yīng)用GH會產(chǎn)生各種不良反應(yīng)，在不同的動物模型中，長期GH刺激會導(dǎo)致GH不敏感，即GH抵抗，甚至腫瘤發(fā)生等，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究，此領(lǐng)域的進(jìn)步對GH的臨床使用具有重要的指導(dǎo)意義。

GH首先與膜蛋白受體GHR結(jié)合，啟動GHR胞內(nèi)區(qū)段與JAK2的結(jié)合，從而導(dǎo)致GHR磷酸化，進(jìn)而STAT5與GHGHR－JAK2的多聚體結(jié)合后磷酸化，磷酸化的STAT5轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。對于該信號通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究具有重要意義，SOCS家族蛋白是GH信號通路的重要調(diào)節(jié)因子。SOCS家族共有8個蛋白，包括SOCS 1～7及CIS。在組織培養(yǎng)和GH敲除的小鼠中，有過慢性GH刺激導(dǎo)致STAT5不敏感的報(bào)道［7］。其機(jī)制包括下調(diào)GHR含量，增加CIS或者SOCS－2的含量及促使SHP2向胞膜移位。但是，這些潛在的受體和受體后水平的研究都還未在正常小鼠中得到驗(yàn)證。本文以正常幼鼠為模型，研究慢性生長激素可能的負(fù)面作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究使用8周齡BALB／C雄性小鼠32只，由廣東省動物研究所提供，在南方醫(yī)院動物房按SPF級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。重組人生長激素（北京默克藥業(yè)咨詢有限公司）；Beckman CS－15R高速冷凍離心機(jī)（美國 Beckman公司）；Bio－Rad 200／2.0電泳儀（美國Bio－Rad）；硝酸纖維素濾膜（美國Millipore公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天公司）；化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑（ECL）試 劑 盒 （美 國 millipore 公 司）；P－Stat5（Tyr694）（D47E7）：＃4322（Cell Signaling公司）；STAT5抗體 （c－17）（sc－835）、CIS 抗 體 （N19）（sc－1529）、SOCS－2（H－74）（sc－9022）、Actin（1－19）（sc－1616）均購自santa cruz公司；山羊抗小鼠－HRP IgG（101843）、山羊抗兔－HRP IgG（101964）及兔抗山羊－HRP IgG（104119）均購自北京中杉金橋公司。EMSA試劑盒（＃20148）購自Thermo公司。

1.2 方法 32只小鼠共分為4組：PBS組、PBS＋single rh－GH、chronic rhGH、chronic rhGH＋single rhGH，每組8只。慢性生長激素刺激組chronic rhGH和chronic rhGH＋single rhGH兩組共16只小鼠每天按1μg／g劑量腹腔注射rhGH，對照組PBS組和PBS＋single rhGH組16只小鼠每天注射等量PBS 0.1mol／L，共3周。注射完最后1次rhGH和PBS 16 h后次日8：00處死，處死前30min PBS組和chronic rhGH兩組小鼠注射PBS 0.1mol／L，PBS＋single rhGH 和chronic rh－GH＋single rhGH按1μg／g腹腔注射單劑量rhGH。處死前使用麻醉劑苯巴比妥充分麻醉，然后快速摘取肝臟液氮速凍，再移至－80℃冰箱長期保存。蛋白信號分子的測定中，肝組織在低溫情況下用含有蛋白酶抑制劑的RIPA液勻漿，蛋白離心制取后，電泳分離，采用免疫印跡法檢測小鼠肝組織總蛋白中STAT5、p－STAT5 、CIS、SOCS－2的表達(dá)；凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）分析STAT5與DNA的黏附能力。

2 結(jié) 果

2.1 慢性rhGH刺激增加小鼠體質(zhì)量 rhGH注射組和PBS對照組的小鼠相比，rhGH組小鼠平均增加體質(zhì)量比PBS對照組小鼠多1.25g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 慢性rhGH刺激降低小鼠肝臟內(nèi)基礎(chǔ)的p－STAT5水平完成最后1次rhGH腹腔內(nèi)注射16h后次日8：00，PBS組和chronic rhGH兩組小鼠處死前30min注射PBS 0.1mol／L，chronic rhGH 組小鼠肝臟細(xì)胞穩(wěn)定的p－STAT5水平（0.41±0.03）顯著低于PBS組（0.86±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但肝臟內(nèi)總STAT5蛋白水平無明顯差異，見圖1。

圖1 PBS組與chronic rhGH組基礎(chǔ)p－STAT5的表達(dá)

2.3 慢性rhGH刺激降低STAT5與DNA的結(jié)合能力 本實(shí)驗(yàn)采用EMSA方法檢測細(xì)胞核STAT5與DNA黏附能力，chronic rhGH組STAT5與DNA結(jié)合的水平（0.78±0.03）顯著低于PBS組（1.22±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 PBS組與chronic rhGH組小鼠肝臟蛋白STAT5與DNA的結(jié)合能力

2.4 慢性rhGH刺激后單劑量rhGH刺激能顯著提高PSTAT5水平 chronic rhGH組與chronic rhGH＋single rh－GH組相比，chronic rhGH＋single rhGH組小鼠肝臟細(xì)胞p－STAT5水平明顯高于chronic rhGH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。慢性rhGH刺激后，小鼠肝臟STAT5能對外源性單劑量rhGH產(chǎn)生應(yīng)答，較處死前30min無外源單劑量rhGH刺激組chronic rhGH組，STAT5的磷酸化明顯增多。

圖3 慢性rhGH刺激后單劑量的rhGH刺激可以誘導(dǎo)大量STAT5磷酸化

2.5 慢性rhGH刺激導(dǎo)致STAT5對外源性rhGH不敏感PBS＋single rhGH組小鼠肝臟細(xì)胞p－STAT5水平（1.19±0.04）顯著高于chronic rGH＋single rhGH組（0.88±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 慢性rhGH刺激抑制外源性rhGH引起的STAT5的磷酸化

2.6 慢性rhGH刺激升高CIS含量，SOCS－2的含量無明顯改變 慢性生長激素刺激組（1.53±0.47）小鼠肝臟細(xì)胞CIS蛋白含量較對照組（0.52±0.01）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但SOCS－2的含量未見明顯差異（圖5）。

圖5 慢性rhGH刺激升高CIS含量，SOCS－2的含量無明顯改變

3 討 論

GH是機(jī)體成長、代謝等生命活動的重要調(diào)節(jié)因子，GH信號的內(nèi)穩(wěn)態(tài)在健康和疾病中都是很重要的。本研究顯示，正常小鼠，當(dāng)接受慢性rhGH刺激以后，機(jī)體同樣產(chǎn)生對rhGH的抵抗效應(yīng)。這提示了，GH抵抗的形成可能是機(jī)體對抗過量外源GH的一種普遍機(jī)制。

本研究中，GH刺激導(dǎo)致的小鼠肝臟內(nèi)基礎(chǔ)p－STAT5水平、由外源rhGH刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的p－STAT5水平以及STAT5與DNA的結(jié)合能力均降低。這與以前報(bào)道的在肝臟CWSV－1細(xì)胞系、雌性大鼠以及基因工程小鼠中的結(jié)果具有一致性［8－10］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)慢性rhGH刺激對內(nèi)源性GH的分泌無影響［11］。這和以前報(bào)道的病理機(jī)制下的GH不敏感的情況不一樣。在慢性腎臟疾病和心臟衰竭的患者中，其血液中GH濃度較健康人更高［12－13］。GH基因工程小鼠血漿中的GH濃度亦是增高［14］。

在白細(xì)胞介素－10（IL－10）結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，肝臟GHR水平下調(diào)可能與STAT5磷酸化水平的抑制有關(guān)［15］。而在本研究在正常小鼠中，當(dāng)慢性生長激素刺激后，GHR水平卻沒有變化［11］。

當(dāng)敲除SOCS－2基因后，小鼠發(fā)育異常，獲得性的巨大癥［16］。在尿毒癥的GH抵抗模型中，部分SOCS基因的表達(dá)增加，其骨骼肌和肝臟的SOCS－2mRNA的表達(dá)大量增多，從而與GH信號通路的不敏感相聯(lián)系［17－19］。然而，本研究的健康小鼠的模型中，SOCS－2的含量與對照組相比，沒有明顯差異。

在轉(zhuǎn)基因鼠和共轉(zhuǎn)染的模型中發(fā)現(xiàn)CIS的增加與GH信號通路不敏感相聯(lián)系［20－22］。這和本研究在健康小鼠模型中的結(jié)論相一致。在健康小鼠中，慢性rhGH刺激導(dǎo)致的STAT5磷酸化降低是通過增加CIS的含量完成的，但CIS的作用位點(diǎn)和具體作用機(jī)制還有待下一步研究。

健康小鼠對慢性生長激素刺激同樣產(chǎn)生抵抗，但其生理背景和其他病理情況不一樣。相對應(yīng)的，生長激素不敏感的機(jī)制也各不相同。這可能說明了，生長激素慢性刺激可以導(dǎo)致機(jī)體信號穩(wěn)態(tài)的紊亂。也可能說明了這種生長激素不敏感是機(jī)體對抗生長激素過度刺激的一種負(fù)反饋機(jī)制。不同病理和生理情況的不敏感機(jī)制各不相同，這說明了細(xì)胞信號穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的多態(tài)性。

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