李 弘，顏麗萍，石曉萍

（廣西壯族自治區(qū)桂林市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科 541001）

氟尿嘧啶至今仍是結(jié)直腸癌化療的首選用藥，其對結(jié)直腸癌有著確切的抑制作用。新型植入用緩釋氟尿嘧啶是長效緩釋抗腫瘤制劑，用其治療惡性實體腫瘤對腫瘤預(yù)后有相當(dāng)大的改善，其優(yōu)勢在臨床已有相關(guān)報道［1－3］。本研究旨在觀察氟尿嘧啶緩釋劑對裸鼠結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）移植瘤的抑制效果，以及驗證其在抗結(jié)直腸癌方面的優(yōu)勢，以期能夠進(jìn)一步指導(dǎo)臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB／c SPF級裸鼠32只，雌性15只，雄性17只，4周齡，體質(zhì)量18～20g，購于桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，批號SCXK桂2007－0001；LoVo細(xì)胞系購于廣西醫(yī)科大學(xué)。

1.2 試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基及胎牛血清（Hyclone公司）；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶－3（cysteinyl aspartate spe－clflc protease－3，caspase－3）多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；5－氟尿嘧啶（5－FU）注射液（25mg／mL，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；氟尿嘧啶緩釋制劑（蕪湖中人科技有限公司，批號20010826，每瓶100mg）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，于細(xì)胞對數(shù)期收集細(xì)胞，做成濃度為1.5×107的細(xì)胞懸液，裸鼠右前肢腋下注射0.2mL細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為3.0×106個／只），10d左右腫瘤長至直徑約5mm為致瘤成功，將其分為A組：磷酸鹽緩沖液（PBS）尾靜脈注射組8只；B組：5－FU尾靜脈注射組8只；C組：5－FU瘤內(nèi)注射組8只；D組：氟尿嘧啶緩釋劑植入組8只。于致瘤成功后5、10、15d給予A組PBS 0.1mL、B組5－FU（100mg／kg）、C組瘤內(nèi)5－FU（100mg／kg）相應(yīng)處理，每次分3次給藥，D組僅在成瘤后5d植入氟尿嘧啶緩釋劑（100mg／kg）。藥物干預(yù)15d后，處死裸鼠測定瘤體大小［測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b），瘤體體積（V）＝0.5a×b2］、腫瘤質(zhì)量。抑瘤率＝［1－實驗組平均腫瘤質(zhì)量（B、C、D組為實驗組）／A組平均腫瘤質(zhì)量×100%］，瘤體甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色后免疫組化檢測caspase－3。

1.3.2 免疫組化及其結(jié)果判定

1.3.2.1 免疫組化法檢測caspase－3蛋白的表達(dá)水平 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3min；對組織抗原進(jìn)行修復(fù)；每張切片加1滴或50μL 13%H2O2，室溫下孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗3次，每次3min；除去PBS液，每張切片滴加1滴或30μL的caspase抗體（1∶100稀釋在0.01mol／mL PBS中），室溫下孵育30 min或4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3min；除去PBS液，每張切片滴加1滴或30μL即用型MaxvisionTM快捷免疫組化試劑，室溫下孵育10～15min，PBS沖洗3次，每次3min；除去PBS液，每張切片滴加2滴或100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5min；自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，PBS或自來水沖洗反藍(lán)，經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。37℃水浴箱孵育40min，PBS沖洗，干燥后鏡檢計數(shù)。

1.3.2.2 免疫組化結(jié)果判定 caspase－3蛋白陽性染色以細(xì)胞質(zhì)呈黃色至棕黃色為主。在400倍鏡下的染色最強區(qū)域中，每張組織切片選10個視野，使用目鏡網(wǎng)格微尺計數(shù)1 000個細(xì)胞，陽性細(xì)胞率＝陽性細(xì)胞數(shù)／腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）、多個均數(shù)之間兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 移植瘤體生長情況、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 32只動物均在10d左右成瘤，成瘤率100%。D組與A、B、C組30d后腫瘤體積比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，F(xiàn)＝27.01），D組與A、B、C組腫瘤質(zhì)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D組抑瘤率較A組明顯升高，見表1。

表1 各組caspase－3的表達(dá)以及腫瘤質(zhì)量及抑瘤率（±s）

表1 各組caspase－3的表達(dá)以及腫瘤質(zhì)量及抑瘤率（±s）

▲：P＜0.05，與A組比較；＊：P＜0.05，與B組比較；＃：P＜0.05，與C組比較；－：表示此項無數(shù)據(jù)。

組別 caspase－3（%）瘤體體積（mm3）腫瘤質(zhì)量（mg）抑瘤率（%）82.3 A 6.75±1.66 3 672±808 2.88±0.22 －B 21.13±3.67 2 421±467 2.31±0.21 19.8 C 48.50±6.62 1 663±692 1.36±0.25 52.8 D 72.88±4.51▲ 951±501＊ 0.51±0.11＃

2.2 HE染色結(jié)果 A組腫瘤細(xì)胞腺管形成、散在少量凋亡、有片狀壞死；腫瘤組織侵襲到脂肪、肌層組織。B組腫瘤細(xì)胞異型性明顯，惡性程度高，腺管狀結(jié)構(gòu)不明顯，小區(qū)腫瘤細(xì)胞有小片凋亡，有小片出血壞死；腫瘤組織有局部侵襲到脂肪組織。C組腫瘤細(xì)胞異型性明顯，腺管樣結(jié)構(gòu)不明顯，小區(qū)腫瘤細(xì)胞片狀凋亡，可見出血壞死灶；腫瘤邊界清楚，未見明顯侵襲。D組腫瘤細(xì)胞異型性不明顯，腺管狀結(jié)構(gòu)不明顯，小區(qū)腫瘤細(xì)胞凋亡明顯，僅有少量壞死，腫瘤組織邊界清晰，未見侵襲脂肪及肌層組織，生長緩慢（圖1）。

2.3 caspase－3免疫組化結(jié)果 caspase－3的表達(dá) A、B、C、D組是呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢（圖2）。

圖1 各組HE染色結(jié)果（×400）

圖2 各組caspase－3的表達(dá)情況（×400）

3 討 論

CRC是近年來發(fā)病率上升最快的消化道惡性腫瘤之一，其病死率也逐步上升［4］。CRC發(fā)病率在全世界位于肺癌、胃癌、乳腺癌之后居惡性腫瘤第4位，其病死率居第3位。在腫瘤的治療方面，手術(shù)為主要方法，但放化療對預(yù)后及防止復(fù)發(fā)十分重要。氟尿嘧啶一直是CRC的首選化療藥物，近年來發(fā)展的緩釋給藥系統(tǒng)使化療藥物能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放，且維持有效的藥物濃度，從而起到顯著的殺滅腫瘤細(xì)胞的效果。氟尿嘧啶緩釋劑較多用于外科手術(shù)中實體腫瘤切除后對腫瘤周邊組織的化療［5－7］，從而殺滅腫瘤的微轉(zhuǎn)移灶，對腫瘤的復(fù)發(fā)及預(yù)后有相當(dāng)大的改善。

本研究的HE染色及抑瘤率結(jié)果表明氟尿嘧啶緩釋劑在對腫瘤的抑制方面比常規(guī)氟尿嘧啶制劑更有優(yōu)勢，其對腫瘤的抑制殺滅效果更好，這可能歸功于緩釋給藥系統(tǒng)使藥物能夠達(dá)到較高的濃度，且作用持久［8］，將其用于結(jié)直腸癌術(shù)后的植入，對腫瘤微轉(zhuǎn)移的殺滅有相當(dāng)大的作用。特別是對于晚期或者不適合做手術(shù)的患者，植入緩釋劑是個理想的選擇。

caspase－3在細(xì)胞凋亡caspase級聯(lián)反應(yīng)中處于執(zhí)行者的核心位置［9］，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及一切凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路。caspase－3的表達(dá)不僅反映細(xì)胞的凋亡水平，而且反映凋亡啟動因素的存在。本研究通過對荷瘤裸鼠采用不同的干預(yù)方式，發(fā)現(xiàn)用藥組caspase－3的表達(dá)都有不同程度增高，提示氟尿嘧啶制劑能啟動腫瘤細(xì)胞的凋亡程序，從而發(fā)揮抗瘤作用，這與張弦等［10］的研究一致。同時氟尿嘧啶緩釋劑組表現(xiàn)出更高的caspase－3表達(dá)，這跟其能夠達(dá)到更高的藥物濃度是分不開的，提示其促凋亡作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，這與符立平等［11］研究的結(jié)果在一定程度是一致的。

綜上所述，氟尿嘧啶緩釋劑能夠更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，進(jìn)而抑制腫瘤的生長，且能減少腫瘤細(xì)胞異型性的發(fā)生，其在抗腫瘤方面呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。氟尿嘧啶緩釋劑植入后能夠在局部達(dá)到較高的藥物濃度，所以其抗腫瘤效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方式，且其作用持久，值得在臨床作為結(jié)直腸癌的化療藥物推廣。

［1］ 馬曉聰，李弘，顏麗萍，等.氟尿嘧啶植入劑治療惡性腫瘤的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（5）：1475－1477.

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