楊慧波，張樹峰，佟繼銘

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

烏頭和半夏是出自“十八反”的藥對，但從古至今在許多處方中配伍使用，如孫思邈《千金要方》中的大五飲丸、半夏湯,《金匱要略》中的赤丸方，宋代《太平惠民和劑局方》中的十四味建中湯等;以及近代外敷治療膝骨性關(guān)節(jié)病的烏頭半夏散，治療乙肝的神丹等[1]。烏頭和半夏能否共用，一直是學(xué)者們爭論的焦點(diǎn)。本研究通過探討生川烏與不同比例生半夏配伍后水浸液中3種生物堿(烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿，生物堿是烏頭的主要毒性成分)的含量，探討生川烏與生半夏毒性最小的配伍比例，以期為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;Hypersil BDS C18(5μm，4.6mm×250mm)色譜柱，大連伊利特分析儀器有限公司。

1.2 試藥 烏頭堿(批號:201101RS)、次烏頭堿(批號:201101RS)、新烏頭堿(批號:201101RS)對照品，云南特法特生物科技有限公司。生川烏(批號:090212)，河北省光明飲生有限公司漢草飲生廠;生半夏(批號:100101)，河北省安國市光明飲片加工廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動相為甲醇-水-氯仿-三乙胺(70:30:2:0.1)，檢測波長235nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl[2]。

2.2 對照品溶液的制備 分別取對照品精密稱定，加二氯甲烷溶解，配成1ml含烏頭堿50μg、新烏頭堿100μg、次烏頭堿160μg的混合對照品溶液。精密量取混合對照品溶液稀釋成1ml含烏頭堿分別為25μg、12.5μg、6.25μg、3.125μg、1.5625μg 的等比稀釋溶液[3]。

2.3 供試品溶液的制備 稱取單味生川烏2g(生川烏:生半夏=1:0)，加3倍量水浸泡3次，每次24h，合并濾液，用等體積乙醚提取3次，乙醚萃取液合并后20℃下蒸干，加二氯甲烷溶解，即得供試品溶液。其余不同配伍比例組處理同單味生川烏[4-6]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍考察:分別精密吸取系列混合對照品溶液10μl，按照2.1的色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的回歸方程分別為:Y=14.502X+0.2743、r=0.9996，Y=11.216X-0.7607、r=0.9998，Y=11.624X-25.495、r=0.9996。烏頭堿在1.5μg/ml-25.0μg/ml、新烏頭堿在17.0μg/ml-85.0μg/ml、次烏頭堿在16.0μg/ml-160.0μg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn):精密吸取烏頭堿濃度為50μg/ml的混合對照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的峰面積RSD值分別為1.02%、1.21%、1.08%(n=5)，說明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取生川烏樣品，按2.3的方法操作制備供試品溶液，重復(fù)測定5次，得新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的平均含量分別為0.080mg/g、0.021mg/g、0.125mg/g，RSD 值分別為1.21%、1.16%、1.13%，表明實(shí)驗(yàn)有很好的重復(fù)性。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn):在相同實(shí)驗(yàn)條件下，各供試品溶液分別于室溫下放置0、4、8、12、24h 后測定，結(jié)果見表1，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn):精密吸取對照品溶液1ml，其中含烏頭堿12.5μg、新烏頭堿25μg、次烏頭堿40μg，置于25ml三角燒瓶中，室溫下?lián)]去二氯甲烷，精密稱取2g生川烏加入三角燒瓶，按照2.3的條件制備供試品溶液，按照2.1的色譜條件進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率(n=5)。結(jié)果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的平均加樣回收率分別為98.79%、97.34%、101.33%，RSD 值 分 別 為1.1%、1.08%1.21%。

2.5 供試品測定 分別精密吸取生川烏、生半夏不同比例配伍組供試品溶液10μl進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2:隨著半夏比例的增加，生川烏中3種生物堿的溶出量均下降，顯示生川烏毒性降低。

表2 生川烏與不同比例生半夏配伍烏頭堿、新烏頭堿與次烏頭堿含量(±s，n=5）

表2 生川烏與不同比例生半夏配伍烏頭堿、新烏頭堿與次烏頭堿含量(±s，n=5）

組別 烏頭堿(mg/g) 新烏頭堿(mg/g) 次烏頭堿(mg/g)1:0 0.02164±0.00051 0.08447±0.00089 0.12517±0.00016 1:0.125 0.01645±0.00017 0.06822±0.00075 0.10975±0.00024 1:0.25 0.01369±0.00032 0.05569±0.00155 0.09710±0.00253 1:0.5 0.01005±0.00027 0.04424±0.00148 0.06306±0.00324 1:0.75 0.00618±0.00020 0.03291±0.00073 0.034798±0.00110 1:1 0.00601±0.00012 0.02273±0.00227 0.02853±0.00029 1:2 0.00359±0.00023 0.01221±0.00017 0.01837±0.00045

3 討論

烏頭類生物堿是生川烏中的主要毒性成分，同時(shí)也是其主要有效成分。烏頭類生物堿的測定方法有酸堿中和法、分光光度法、薄層掃描法等，目前最常用的是薄層掃描法中的高效液相色譜法(HPLC)[7]。2010版《中國藥典中采用高效液相色譜法可以同時(shí)測定6種單酯型和雙酯型生物堿的含量，操作簡便，樣品用量少，雜質(zhì)分離效果好，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿均達(dá)到了基線分離，回收率、重現(xiàn)性、精密度均很好[8]。本研究研究發(fā)現(xiàn)，生川烏中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量隨生半夏加入量的增加而降低，說明生川烏的毒性和藥效也會隨著半夏加入量的增加而降低，但與十八反中二藥合用會引起劇烈的毒性反應(yīng)或副作用的說法不符，有待進(jìn)一步的研究探討。

[1]李振虎,李凡,胡江.“神丹”加味湯治療慢性乙肝111例的臨床觀察[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2006,(4):6-7.

[2]羅霄，彭善貴，文永盛，等.HPLC測定制川烏中的烏頭堿次烏頭堿和新烏頭堿[J].華西藥學(xué)雜志，2010,25(4):472-473.

[3]梁生旺.中藥制劑分析[M].第2版.北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003.78-79.

[4]鄭杭生，馮年平.中藥飲品制川烏、制草烏中烏頭堿、次烏頭堿的HPLC測定[J].藥物分析雜志，2005，25(1):34-36.

[5]劉嵐，范智超，張志琪.HPLC同時(shí)測定成藥中4種烏頭類生物堿含量[J].藥物分析雜志，2010,30(2):236-239.

[6]付宇，高建，趙宇，等.烏頭堿含量測定方法的建立[J].化學(xué)工程師，2010，(11):29-30.

[7]周玲.烏頭類中藥化學(xué)成分及其生物堿含量測定方法的研究概況[J].中國中醫(yī)藥，2011，9(2):223-224.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第1部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.36-38.