杜 麗，成 鷹，史巧蕓，焦寒偉，榮 輝，張珈寧，賈曉曉，郭蒔雨，朱華培，王鳳陽

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?70228；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南?？?70228；3.海口市動物基因工程重點實驗室，海南?？?70228）

戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的、以黃疸為主的急性病毒性肝炎［1］。在我國發(fā)生的急性病毒性肝炎流行中，戊型肝炎約占10%，主要以Ⅰ型HEV和Ⅳ型HEV為主［2－3］。近年來，戊型肝炎作為一種重要的人獸共患病，引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注［4－5］。

HEV基因組全長7.6kb，ORF1、ORF2和ORF3共3個編碼框，其中，pORF3與細胞信號調(diào)控關(guān)系密切［6］。脂肪因子既包括傳統(tǒng)意義上的瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、內(nèi)脂素，也包括與炎癥及免疫相關(guān)的細胞因子，如腫瘤壞死因子－A、白細胞介素－6等。這些因子的生成與功能失調(diào)與肝臟炎癥、纖維化和免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)［7－11］。為了探討 HEV ORF3影響靶細胞脂肪因子表達的分子機制，應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)分析穩(wěn)定表達ORF3的HEK293細胞顯著上調(diào)／下調(diào)的脂肪因子的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 穩(wěn)定表達genotypeⅣHEV的pEGFP－ORF3的HEK293細胞和穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞由本實驗室構(gòu)建［6］并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 蛋白芯片 Human Adipokine Antibody Array Kit為RayBiotech公司產(chǎn)品，該芯片包括62種人脂肪因子的抗體，以及確保試驗成立的陰性和陽性對照（圖1）。

1.2 方法

1.2.1 細胞總蛋白提取 穩(wěn)定表達genotypeⅣHEV的pEGFP－ORF3的HEK293細胞，穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞總蛋白提取參照文獻［6］進行。

1.2.2 蛋白芯片分析 蛋白芯片分析參照說明書進行：①封閉與孵育。將點有抗體的膜浸入2mL封閉液中，室溫孵育30min后，將膜與1mL總蛋白樣本在室溫條件下在密封袋中孵育1h～2h。取出膜后，用洗膜緩沖液洗3次，每次5min。加入生物素標記的抗體，室溫條件下在密封袋中孵育1h～2h。取出膜后，用洗膜緩沖液洗3次，每次5min。加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫條件下在密封袋中孵育2h。取出膜后，用洗膜緩沖液洗3次，每次5min。②檢測。加入250μL檢測液，室溫條件下孵育2min后，用X光片檢測信號。

2 結(jié)果

將來自穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞的蛋白樣本，來自穩(wěn)定表達pEGFP－ORF3的 HEK293細胞的蛋白樣本，和來自HEK293細胞的DMEM培養(yǎng)液上清的蛋白樣本，分別與芯片1，芯片2和芯片3雜交。蛋白芯片雜交結(jié)果顯示，在1a、1b、2a、2b、14i、14j的6個點，3張膜陽性對照 （POS）的信號均成立，在3a、3b、4a、4b的4個點，3張膜陰性 對照 （NEG）均成立 （圖2）。

圖1 人脂肪因子抗體芯片F(xiàn)ig.1 Human adipokine antibody array

圖2 兩種細胞系人脂肪因子表達的差異Fig.2 The relative adipokine expression of two stable cell line

1c和1d兩個點的信號表明，穩(wěn)定表達pEGFPORF3的HEK293細胞的Fas表達水平高于穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞和HEK293細胞的Fas表達水平；7i和7j兩個點的信號表明，穩(wěn)定表達pEGFP－ORF3的HEK293細胞的TIMP－2表達水平高于穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞和HEK293細胞的TIMP－2表達水平；6a和6b兩個點的信號表明，穩(wěn)定表達pEGFP－ORF3的HEK293細胞的ACE－2表達水平低于穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞的ACE－2表達水平（圖2）。

3 討論

pORF3是HEV的重要病毒蛋白，與細胞信號調(diào)控關(guān)系密切。脂肪因子的生成與功能失調(diào)與肝臟炎癥、纖維化和免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)。探討pORF3的表達對于脂肪因子表達的影響可以為揭示HEV的致病機制提供重要線索。

傳統(tǒng)的脂肪因子表達檢測手段是ELISA。本試驗中所應(yīng)用的蛋白芯片技術(shù)可以同時對62種人脂肪因子的表達進行檢測，極大地提高了檢測效率及檢測的準確性。

Fas（也稱APO－1或CD95）屬于腫瘤壞死因子受體（TNF－R）家族，包括1個細胞內(nèi)“死亡功能域”，能夠?qū)е碌蛲龅陌l(fā)生［12］。在穩(wěn)定表達EGFPORF3的HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)Fas的表達水平升高，這一結(jié)果預(yù)示著pORF3在靶細胞的表達可能與凋亡發(fā)生相關(guān)。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定表達EGFP－ORF3的HEK293細胞，金屬蛋白酶組織抑制劑－2 （tissue inhibitors of metalloproteinases 2，TIMP－2）的表達升高。根據(jù)文獻報道，在慢性肝病和肝纖維化的動物模型，均觀察到了TIMP－2表達升高［13］。說明pORF3的過表達可能和肝纖維化具有密切聯(lián)系。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑2（angiotensin－converting enzyme 2，ACE2）通過剪切Ang－Ⅱ，生成Ang－（1－7），抑制能促進炎癥因子、生長因子以及促纖維化因子釋放的Ang－Ⅱ信號途徑［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定表達pEGFP的HEK293細胞相比，穩(wěn)定表達pEGFP－ORF3的HEK293細胞的ACE－2表達水平降低，說明pORF3的表達可能通過降低ACE－2表達水平，解除對于炎癥因子、生長因子以及促纖維化因子釋放的作用。

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