李向軍， 付秀華， 劉建軍， 杜 勇， 洪 治

1.中國計量學(xué)院太赫茲技術(shù)與應(yīng)用研究所，杭州 310018；

2.中國計量學(xué)院信息工程學(xué)院，杭州 310018

引 言

膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維性蛋白質(zhì)，由三個多肽超螺旋結(jié)構(gòu)組成，平均分子量為0.36 MD，是重要的細(xì)胞外間質(zhì)成分，廣泛存在于人體的皮膚、骨骼、肌肉、軟骨、關(guān)節(jié)等組織中，起支撐、修復(fù)、保護(hù)三重作用，生理功能極其重要。因此，膠原蛋白成為臨床應(yīng)用較為廣泛的蛋白質(zhì)類藥物。然而，同大多數(shù)蛋白類藥物一樣，膠原蛋白在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲藏過程中，多以固體形式存在，易受環(huán)境溫度的影響而發(fā)生變性。這是由于膠原蛋白的穩(wěn)定性有賴于分子間和分子內(nèi)各種作用的協(xié)同效應(yīng)，加熱可使分子間作用力減弱，破壞三股螺旋的穩(wěn)定性，從而使其喪失生物功能[1]。

目前，用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的有示差掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)[2]、核磁共振 (nuclear magnetic resonance，NMR)[3]、X射線衍射[4]、微波介電譜[5]和各類光譜法。介電譜和光譜法具有快速、無損的特點(diǎn)，因而更具應(yīng)用潛力。目前已應(yīng)用到蛋白質(zhì)藥物檢測的光譜法包括紫外吸收譜、可見光吸收譜、圓二色譜 (circular dichroism，CD)、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜 (Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)和拉曼光譜等。其中，大部分技術(shù)都不能提供分子的整體構(gòu)象和分子間相互作用的信息，而這些卻是對蛋白質(zhì)功能起決定性作用的[6]。

人們發(fā)現(xiàn)，反映DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子構(gòu)象的分子集體振動轉(zhuǎn)動能級位于THz波段，雖然我們可以用FTIR、自由電子激光、可調(diào)諧p-Ge激光和 (terahertz time domain spectroscopy，THz-TDS)等多種技術(shù)得到物質(zhì)的寬帶THz譜，但THz-TDS技術(shù)的出現(xiàn)才真正改變了THz譜研究的面貌。THz-TDS系統(tǒng)可以在常溫下工作，系統(tǒng)體積小，并可方便地用激勵源激發(fā)樣品，且光路靈活，可隨時監(jiān)測；尤其是可以同時測量太赫茲波電場的幅度和相位，可以直接得到樣品的吸收系數(shù)和折射率，或復(fù)介電常數(shù)，比單一的吸收譜可提供更多的樣品信息。這有利于對分子的振動/轉(zhuǎn)動模式進(jìn)行極化響應(yīng)建模，利用各種動力學(xué)理論在THz波段研究蛋白質(zhì)熱變性問題[5]。THz-TDS除了可以對物質(zhì)的復(fù)介電響應(yīng)表征外，還可以進(jìn)行具有時間分辨率的測量，即對分子構(gòu)象改變而引起的振動/轉(zhuǎn)動模式演化進(jìn)行實(shí)時測量。

研究者已經(jīng)利用THz-TDS技術(shù)對蛋白質(zhì)展開了一系列研究。Markelz等[7]首次利用THz-TDS研究了DNA、牛血清蛋白和膠原質(zhì)在0.06～2.00 THz波段的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這些生物分子的THz譜可以很好地反映它們的低頻集體振動模式。他們對集體振動模式的馳豫極化進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，生物大分子在THz波段的介電響應(yīng)譜帶范圍較寬且特征吸收并不明顯，但該響應(yīng)卻對水合作用、溫度、綁定、構(gòu)造改變等高度敏感[6]。He等[8]通過THz-TDS技術(shù)研究天然狀態(tài)和變性的雞蛋清溶菌酶的動態(tài)躍遷，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不是產(chǎn)生動態(tài)躍遷的必要因素，而與溫度相關(guān)。Havenith等[9]利用THz-TDS研究了蛋白質(zhì)折疊過程中的THz電場衰減和相轉(zhuǎn)移，并與熒光法、圓二色譜、小角度X射線散射的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)THz譜可檢測折疊早期和二級結(jié)構(gòu)形成時結(jié)合水-蛋白質(zhì)相互作用的重排現(xiàn)象，證明了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的形成與溶劑動力學(xué)相關(guān)。Chen等[10]利用THz-TDS觀察到了PsbO蛋白的可逆性構(gòu)象變化。以上研究都證明了利用THz-TDS譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化的巨大潛力。上述THz-TDS對蛋白質(zhì)的動力學(xué)研究多在溶液中或水合狀態(tài)下進(jìn)行，用其研究固體蛋白質(zhì)的溫度穩(wěn)定性還未見諸文獻(xiàn)報道。

本文利用太赫茲時域光譜技術(shù)對膠原蛋白從25℃至120℃的加熱變性過程進(jìn)行了THz光譜測量，發(fā)現(xiàn)加熱后的吸收和折射譜均逐漸減小，與DSC測量結(jié)果對比，確認(rèn)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了解折疊的熱變性過程。然后，把吸收率和折射率轉(zhuǎn)化為介電譜，并利用一階Debye模型擬合加熱過程中膠原蛋白的介電譜，獲得了相應(yīng)的弛豫時間，發(fā)現(xiàn)這些弛豫時間隨溫度變化而逐漸變大，與加熱過程中分子內(nèi)部構(gòu)象解折疊變性過程中的偶極矩變化對應(yīng)，并可以用Arrihenius方程擬合，得到的活化能為5.53 kJ/K·mol。同時，利用介電弛豫理論對其變化進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步利用THz-TDS技術(shù)研究固態(tài)蛋白質(zhì)及多肽類藥物的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行了有益的探索。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料及裝置

膠原蛋白為購自Sigma公司的牛肌腱膠原蛋白I型，純度大于95%以上，樣品為絮狀晶體粉末，實(shí)驗(yàn)前未經(jīng)進(jìn)一步純化處理。實(shí)驗(yàn)前，在4 MPa壓力下將膠原蛋白制備成直徑為13 mm、厚度約為1.5 mm左右的結(jié)構(gòu)均勻且兩端面平行的測試樣品。然后，分別在變溫裝置中測量樣品在25、50、75和120℃下的THz時域譜。加熱完成后，在返回25℃時，再測量一次樣品的THz時域譜。

THz-TDS實(shí)驗(yàn)裝置是購自美國Zomega公司的Z-2太赫茲時域光譜系統(tǒng)[12]，該系統(tǒng)信噪比可達(dá)70 dB，整個測量環(huán)境為干燥的氮?dú)猸h(huán)境，相對濕度為0%。

示差掃描量熱儀為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品，型號為Metttler SMP/PF7548/MET/600 W，升溫速率設(shè)置為10℃/min，試樣測量時的氣氛為空氣，鋁坩堝作為參考。

數(shù)據(jù)處理及理論方法

樣品THz光學(xué)參數(shù)的提取采用Duvillaret等人[13]提出的方法，參考信號和樣品信號分別是通過測量氮?dú)夂蜆悠返奈宕纹骄玫腡Hz時域信號。將時域信號進(jìn)行快速傅里葉變換得到參考和樣品的THz頻域信號，分別記為Eref(ω)和Esam(ω)，兩者相除可以得到傳遞函數(shù)H(ω)：

其中，?=n－ik，代表樣品的復(fù)折射率，n為折射率，k是消光系數(shù)；ω代表頻率；d表示樣品厚度；ρ(ω)為H(ω)的振幅；φ(ω)為H(ω)的相位。經(jīng)過數(shù)學(xué)推導(dǎo)可以得到樣品的折射率 n(ω)、消光系數(shù) k(ω)、吸收系數(shù) α(ω)和復(fù)介電譜ε~(ω)等光學(xué)參數(shù)。

介電譜描述物質(zhì)或體系的介電常數(shù)隨電場頻率的變化，本質(zhì)上是物質(zhì)與電磁波相互作用的結(jié)果，從近紅外到紫外的大約1011～1016Hz頻率段，反映了電磁場與原子的外層電子、晶體中的原子或離子相互作用的位移極化及分子偶極極化響應(yīng)。其中，THz介電譜對分子轉(zhuǎn)動和分子間相互作用非常敏感，可以從介電弛豫過程中了解分子運(yùn)動的特征時間，獲得與分子結(jié)構(gòu)與運(yùn)動相關(guān)的大量信息[6]。

弛豫是指系統(tǒng)在外力場的作用下 (如力場，電場、磁場和化學(xué)勢場)，從一個平衡態(tài)過渡到另一個平衡態(tài)時經(jīng)歷的過程，其描述特征參量為弛豫時間，若該過程必須克服高度為△E的能壘，Kauzmann等人[14]指出該弛豫響應(yīng)對應(yīng)一個激活反應(yīng)，相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)變化和鍵的破壞與重排導(dǎo)致偶極子運(yùn)動變化，則弛豫時間可以描述為：

其中，kb是玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，τ0稱為指前因子，△E一般也被稱為激活能或活化能等，符合Arrhenius方程描述的規(guī)律。Markelz等[15]研究發(fā)現(xiàn)，可以用單一弛豫時間Debye模型來表征固態(tài)蛋白質(zhì)分子在溫度變化過程中，由于分子結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的介電弛豫響應(yīng)過程，其表達(dá)式為：

本文認(rèn)為，介電弛豫時間可以反應(yīng)分子構(gòu)象隨溫度發(fā)生的變化。蛋白質(zhì)分子通過加熱從天然態(tài)到變性狀態(tài)過程中分子的解折疊過程，可用弛豫時間加以定量刻畫。而活化能則反映該加熱變性過程的難易程度，可以作為蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的一個定量指標(biāo)。

結(jié)果與討論

膠原蛋白的THz光譜

分別在變溫裝置中測量25、50、75和120℃下固體膠原蛋白樣品THz的時域譜，經(jīng)過傅里葉變換得到頻域譜，利用公式(2)～(4)得到樣品的THz吸收系數(shù)和折射率，如圖1所示。

從圖1中可以看出，膠原蛋白的吸收曲線比較平滑，呈現(xiàn)一種類似玻璃態(tài)的響應(yīng)，是諧振和弛豫過程的一種積分效果[6]。膠原蛋白加熱過程中的吸收譜和折射譜整體上呈減小趨勢，可能有兩方面的原因，一方面，經(jīng)過凍干處理的膠原蛋白仍含有少量維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)晶水和水合水，加熱將會使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)晶水和表面的水合水的水分子減少，而水分子在THz波段的吸收率和折射率都比較大；另一方面，膠原蛋白分子中含有的螺旋結(jié)構(gòu)在加熱激活的過程中具有伸展和解折疊的趨勢。加熱變性過程在吸收譜中的變化不十分明顯，但在折射率譜中則非常清晰，這體現(xiàn)了THz-TDS的優(yōu)勢。已知在加熱到一定溫度后，膠原蛋白還將發(fā)生不可逆的熱變性過程，即使溫度重新降到室溫時，膠原蛋白分子也不能恢復(fù)到變性前的各級構(gòu)象結(jié)構(gòu)?？梢詮膱D1中看到，加熱后返回25℃時測量的吸收系數(shù)和折射率與開始25℃時的值相差較大，而與120℃時測量的比較接近，說明了加熱變性的不可逆性。為了證實(shí)本文膠原蛋白樣品加熱到120℃時已經(jīng)發(fā)生了不可逆的熱變性過程，我們用DSC法測量了相同樣品，得到膠原蛋白在加熱過程中的熱流變化軌跡 (如圖2所示)?？梢钥吹?，本實(shí)驗(yàn)樣品在100℃左右發(fā)生了熱變性。

為了定量分析這種加熱過程對膠原蛋白分子THz波段介電響應(yīng)的改變，分別用公式(5)和公式(7)計算擬合了膠原蛋白THz介電譜的虛部和實(shí)部，見圖3(A)～(D)。從圖3介電譜中可以更加清晰地看到，膠原蛋白分子在脫水過程和解折疊期間發(fā)生了顯著的偶極矩變化，對應(yīng)的弛豫時間相應(yīng)變化。這也是多數(shù)吸收譜光譜無法提供的重要信息。

圖3(C)和(D)擬合的結(jié)果說明，可以用一階Debye模型來表征固態(tài)蛋白質(zhì)分子在加熱過程中由于分子結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致的介電弛豫響應(yīng)過程，與文獻(xiàn)[15]的結(jié)論一致。同時，表1給出了加熱過程中樣品在25、50、75和120℃及返回25℃時，擬合得到的單一弛豫時間τ的一階Debye模型的各個參數(shù)。從表1中可以看出，膠原蛋白分子的弛豫時間隨著溫度的升高而逐漸變大，說明固體蛋白質(zhì)的熱變性是構(gòu)象漸變過程，即變性過程中維系膠原蛋白空間結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞，原有的空間結(jié)構(gòu)改變，整個分子的形狀具有從天然緊密的球形結(jié)構(gòu)伸展為松散的無特定空間結(jié)構(gòu)的鏈狀分子的趨勢；另外，返回25℃時測量的弛豫時間與開始25℃時的值相差較大，而與120℃時測量的比較接近，不難推測，膠原蛋白在加熱變性后，不但失去了水合水分子，而且空間構(gòu)象復(fù)雜度降低，膠原蛋白分子中含有的三個多肽超螺旋結(jié)構(gòu)在加熱激活過程中具有伸展的趨勢，這使其THz介電響應(yīng)的偶極矩改變，相應(yīng)的弛豫時間變長，且該變性過程不可逆，變性后的空間結(jié)構(gòu)在返回室溫時基本保持不變。該現(xiàn)象可以用蛋白質(zhì)變性的漸變模型做較好的解釋[16]，即固體蛋白質(zhì)的熱變性過程是從天然態(tài)逐漸過渡到變性態(tài)的漸變過程，除自然態(tài)和變性態(tài)之外，還存在若干過渡態(tài)。

表1 擬合得到的膠原蛋白加熱過程中及返回25℃時的弛豫時間Table 1 Fitted relaxation time for collagen during heating and back to 25℃

為了進(jìn)一步定量分析這種由加熱引起的膠原蛋白變性過程，本文發(fā)現(xiàn)可以利用公式(6)給出Arrhenius方程擬合加熱過程中的弛豫時間τ(如圖4所示)，計算得到變性過程的活化能為5.53 kJ/K·mol，可以定量刻畫加熱變性過程的難易程度。這也印證了玻璃態(tài)動力學(xué)理論可以用于蛋白質(zhì)熱變性的研究，說明蛋白質(zhì)是一種韌性玻璃態(tài)物質(zhì)[17]。無定形固體分為韌性玻璃態(tài)和脆性玻璃態(tài)物質(zhì)兩大類，其中，韌性玻璃態(tài)物質(zhì)的許多動力學(xué)性質(zhì)滿足Arrhenius方程。固體蛋白質(zhì)作為玻璃態(tài)物質(zhì)，其分子主骨架無法大幅移動，而側(cè)鏈則可以擺動或轉(zhuǎn)動，形成不同構(gòu)象。

結(jié)論及展望

本文利用太赫茲時域光譜技術(shù)，對膠原蛋白從25℃至120℃的加熱變性過程進(jìn)行了THz光譜測量，發(fā)現(xiàn)加熱前后的吸收和折射譜有明顯變化。主要原因是加熱將會使蛋白質(zhì)原有表面的水分子減少，且高溫加熱使得分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)果吸收減小，折射率變小。變性后膠原蛋白分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了不可逆的根本變化。同時，利用一階Debye模型擬合了加熱過程中膠原蛋白的介電譜，獲得了相應(yīng)的弛豫時間，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白分子的脫水過程和折疊結(jié)構(gòu)改變期間發(fā)生了顯著的偶極矩變化，弛豫時間隨著溫度的升高而逐漸變大，說明膠原蛋白的加熱變性是構(gòu)象漸變過程。弛豫時間隨溫度的變化滿足Arrihenius方程，擬合得到的活化能為5.53 kJ/K·mol，該數(shù)值表征了膠原蛋白加熱變性過程的難易程度，給出了其在固態(tài)下熱穩(wěn)定性的定量評價標(biāo)準(zhǔn)。同時，實(shí)驗(yàn)印證了固態(tài)蛋白質(zhì)可以被看做一種韌性玻璃態(tài)物質(zhì)，在分子主骨架不能移動的情況下，其側(cè)鏈在不同構(gòu)象間轉(zhuǎn)換的時間為皮秒量級。

我們下一步的工作將結(jié)合分子模擬計算工具，全面揭示膠原蛋白加熱變性的物理機(jī)理，特別是其非諧振弛豫響應(yīng)無法被常用分子模擬軟件中的正規(guī)諧振模式所包含的、來自蛋白分子的肽鏈在THz電磁場作用下的偶極子弛豫過程[15]，因?yàn)檫@些非諧振響應(yīng)必須通過計算整個體系中所有分子的運(yùn)動軌跡才能全面揭示。

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