陸久維， 翟宇佳， 孫 飛

中國科學院生物物理研究所，生物大分子國家重點實驗室，北京100101

引 言

早在130年前，Ringer[1]就發(fā)現(xiàn)鈣離子在心肌細胞收縮中具有重要作用，由此開啟了研究鈣信號的時代。事實上，細胞內(nèi)鈣信號的形成和傳導都是受到高度調(diào)節(jié)的，存在“開”和“關”兩種機制以精確調(diào)控鈣離子的時空分布[2]。

線粒體作為細胞內(nèi)的能量工廠，其提供的能量約占細胞生命活動所需能量的95%[3]。此外，線粒體還參與細胞凋亡、細胞周期調(diào)控及細胞發(fā)育調(diào)節(jié)等生理活動[4]。研究發(fā)現(xiàn)，無論是分離的還是體內(nèi)的線粒體都可以自發(fā)吸收和釋放鈣離子。那么，鈣離子是否在線粒體發(fā)揮生理功能中起到重要作用呢？事實上，人們對于這個問題的認識經(jīng)歷了近半個世紀的發(fā)展歷程[5]。研究表明，鈣離子不但能被線粒體吸收和釋放，而且線粒體的鈣吸收和釋放在維持胞漿鈣穩(wěn)態(tài)中起到十分重要的作用[6]；線粒體內(nèi)自由鈣離子的濃度與其能量代謝水平和膜的通透性改變密切相關[7～9]；線粒體的鈣吸收和釋放過程也會對細胞內(nèi)的鈣信號進行修飾[10]；該過程的異常與心臟病、癲癇和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生關系密切[11～13]。

線粒體是具有雙層膜的鈣存儲細胞器，鈣離子分布在其膜間隙和線粒體基質(zhì)中。由于線粒體外膜的鈣離子高通透性，膜間隙內(nèi)的鈣離子濃度與胞漿內(nèi)的鈣濃度相當。在靜息狀態(tài)下，線粒體基質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度 (～100 nmol/L)與胞漿內(nèi)相當[14]。當細胞處于興奮時，胞漿內(nèi)的鈣濃度可以達到2～3μmol/L，而此時，線粒體基質(zhì)內(nèi)的鈣濃度可以上升至10μmol/L，甚至更高 (500μmol/L)[15,16]。那么，線粒體上存在哪些途徑來轉(zhuǎn)運鈣離子呢？

本文將結(jié)合最新研究進展，就線粒體外膜鈣離子轉(zhuǎn)運——線粒體外膜電壓依賴的陰離子選擇性通道 (voltage dependent anion-selective channel，VDAC)，線粒體內(nèi)膜鈣離子吸收——依賴單向吸收體的鈣離子吸收(mitochondrial calcium uniporter，MCU)、快速鈣離子吸收 (rapid mitochondrial calcium uptake，RaM)和依賴線粒體雷諾丁受體 (mitochondrial ryanodine receptor，mRyR)的鈣離子吸收，以及線粒體內(nèi)膜鈣離子釋放——鈉離子依賴(mitochondrial Na+-dependent calcium efflux，mNCX)和鈉離子非依賴的鈣離子釋放(Na+-independent calcium efflux，NICE)等鈣離子轉(zhuǎn)運方式進行綜述 (圖1)。

鈣離子穿梭線粒體外膜

線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道 (VDAC)是受線粒體外膜電勢調(diào)控的一類選擇性通道。目前發(fā)現(xiàn)人源線粒體中構成通道的蛋白存在VDAC1～3三種形式[17]，它們有著組織表達差異性[18]，且能夠與不同的調(diào)節(jié)蛋白相互作用而行使功能[19～21]；VDAC是許多陰離子、陽離子和線粒體代謝底物的轉(zhuǎn)運通道，這其中也包括鈣離子[22～24]。那么，VDAC是怎樣運輸鈣離子的呢？脂質(zhì)體實驗表明，開放狀態(tài)的VDAC直徑大小在3～4 nm之間，能夠允許小于5 kDa的分子自由通過[25]；鼠VDAC1-Ca2+晶體結(jié)構及疊氮化釕 (AzRu)結(jié)合顯示VDAC1中的兩個谷氨酸即為鈣離子結(jié)合位點[26,27]；Rapizzi等[28]在HeLa細胞和骨骼肌細胞中過表達VDAC1時發(fā)現(xiàn)，在激動劑誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放的同時，線粒體內(nèi)鈣離子濃度升高的幅度高于對照組；反之，敲除VDAC1則線粒體內(nèi)的鈣離子濃度會降低。結(jié)合上述現(xiàn)象，Rizzuto等[29]認為鈣離子可以自由穿梭VDAC，VDAC的拷貝數(shù)決定線粒體外膜轉(zhuǎn)運鈣離子的能力。然而，Bathori等[30]發(fā)現(xiàn)VDAC的開和關與鈣離子濃度密切相關。因此，相信VDAC轉(zhuǎn)運鈣離子不僅依賴于VDAC的拷貝數(shù)，還存在調(diào)節(jié)孔道開關的其他途徑。

鈣離子由膜間隙進入線粒體基質(zhì)

鈣離子由膜間隙進入線粒體基質(zhì)主要有三種方式，分別為依賴線粒體鈣離子單向吸收體 (MCU)的單向鈣吸收、快速線粒體鈣吸收 (RaM)，以及依賴線粒體雷諾丁受體 (mRyR)的鈣吸收。此外，研究還提示存在其他的鈣離子進入途徑[31]，線粒體內(nèi)膜上負責鈣離子釋放的交換體在病理狀態(tài)下也可將鈣離子吸收至線粒體內(nèi)[32]。

依賴MCU的單向吸收

在依賴MCU的單向吸收過程中，鈣離子是單一的被吸收而不伴隨其他離子的跨膜轉(zhuǎn)運[33]；無論是氧化磷酸化、ATP水解還是鉀離子載體——纈氨酶素(valinomycin)建立的內(nèi)膜跨膜電勢都可以激活此吸收過程[34～36]；單向吸收動力學方程具有電化學擴散過程特征[36,37]。因此，鈣離子依賴MCU進入基質(zhì)的過程是一個依賴于線粒體內(nèi)膜電勢、不需要額外能量、順鈣離子電化學梯度擴散的過程。此外，據(jù)報道MCU只傾向于介導鈣離子的吸收而不介導鈣離子的釋放，因此，研究者將MCU稱為單向吸收體[38]。

單向吸收過程的抑制劑、激動劑及動力學特征

依賴MCU單向吸收的過程除了轉(zhuǎn)運鈣離子外，其活性還受胞漿鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，特別是當胞漿鈣離子濃度持續(xù)上升時，其活性會受到抑制[39,40]。此外，其它離子、化合物及藥物類分子也可抑制此吸收過程，主要有：1)可以被單向吸收方式所轉(zhuǎn)運的競爭型抑制劑，如鍶離子 (Sr2+)、錳離子 (Mn2+)、鋇離子 (Ba2+)、亞鐵離子 (Fe2+)及鑭系元素離子(La3+、Gd3+和 Pr3+等)，MCU對它們的選擇為 Ca2+＞Sr2+?Mn2+＞Ba2+＞Fe2+＞La2+[38,41～43]。2)不能被單向吸收方式所轉(zhuǎn)運的抑制劑，包括：①鎂離子、氫離子和聚氨類，它們可能通過結(jié)合或屏蔽轉(zhuǎn)運位點而抑制鈣離子的轉(zhuǎn)運[36]；②釕紅、釕360和六胺合鈷等強效型抑制劑，它們可結(jié)合MCU的鈣離子結(jié)合位點，從而起抑制作用。相比競爭型抑制劑，這些強效型抑制劑具有長效性且抑制常數(shù)Ki通常在10 nmol/L以下[38]；目前，釕360是抑制效應最強、最為常用的抑制劑，突變?nèi)嗽碝CU的259位絲氨酸可消除其抑制作用[44]。3)藥物類抑制劑，包括Beta類抑制物[45]、胍類[46]和利尿類[47]等。

無機磷酸可以增加MCU吸收鈣離子的速率，但其中的機理目前還未知[48]。在線粒體外低鈣離子濃度條件下，包括精胺和亞精胺在內(nèi)的多胺類化合物可以激活MCU的吸收過程[49]，但所需濃度具有細胞依賴性[50]。此外，由于單向吸收過程對鈣離子具有協(xié)同性，因此，上述競爭性抑制劑在低濃度時也可起激活作用。值得注意的是，精胺在線粒體外高鈣離子濃度時反而對MCU具有抑制作用[51,52]。

單向吸收過程的動力學方程為 V={[V max[Ca2+]H]/[K0.5H+[Ca2+]H]}×{(ΔФ/2)(eΔФ/2)/[sin h(ΔФ/2)]}。其中，V max為最大轉(zhuǎn)移速率，ΔФ與內(nèi)膜跨膜電勢相關，K0.5為解離常數(shù)，H為希爾系數(shù)[53]。研究發(fā)現(xiàn)，不同組織來源的、依賴MCU吸收鈣離子過程的V max存在差異性，有報道指出肝臟線粒體的Vmax要高于心臟線粒體[36]。早期研究發(fā)現(xiàn)分離線粒體的K0.5要大于10μmol/L[54～56]，因此，人們最初懷疑細胞內(nèi)的線粒體是否真的會通過此吸收模式來大量吸收鈣離子。Rizzuto等[57]對細胞內(nèi)鈣離子濃度的研究改變了人們對于細胞內(nèi)鈣離子分布的認識。研究表明，細胞內(nèi)的部分線粒體會趨向定位于鈣微區(qū)的部位，這些區(qū)域的鈣離子濃度在興奮時可達到50μmol/L，甚至更高。因此，目前大家普遍接受細胞內(nèi)的線粒體可以通過MCU來吸收鈣離子的事實。根據(jù)分離線粒體的鈣離子吸收動力學方程，人們推算出H為2；結(jié)合其他實驗，Gunter等[36]推測MCU存在一個鈣離子激活位點和一個轉(zhuǎn)運位點。然而，最近的研究顯示，細胞內(nèi)線粒體的單向吸收過程似乎對鈣離子具有更高的協(xié)同性——H約為3.2[58]。

MCU的分子機制

自單向吸收過程被發(fā)現(xiàn)以來，人們一直力圖找出它的分子本質(zhì)。1972年，Sottocasa等[59]分離出一種被鑭和釕紅抑制的糖蛋白。1993年，Saris等[60]從鼠肝臟的線粒體內(nèi)膜體(mitoplast)上分離出一個40 kDa的糖蛋白，并檢測了其鈣離子吸收活性。1994年，Zazueta等[61]從鼠腎臟線粒體中分離出一種可以介導鈣吸收并被釕360所抑制的20 kDa蛋白。這些早期努力都未真正找到MCU。根據(jù)估算MCU的turnover數(shù)并與已知通道和載體蛋白的turnover數(shù)進行比較，人們推測MCU可能是載體蛋白或門控通道[36]。2004年，Kirichok等[38]通過膜片鉗技術研究了COS-7細胞的線粒體內(nèi)膜體 (mitoplast)的鈣通道，發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)膜上存在一種鈣離子高選擇性的內(nèi)向整流 (inwardly rectifying current)通道，并稱之為MiCa(mitochondrial calcium)通道；他們分析了MiCa通道的動力學和抑制劑特征，認為MiCa通道即為MCU。至此，人們第一次認識到MCU是一個通道而不是一種載體蛋白。然而，MCU的基因篩查直到最近幾年才有了新的突破。

2007～2008年，Trenker等[62]和 Brookes等[63]通過對 UCP2/UCP3(uncoupling protein 2/3)的研究，否定了它們作為 MCU的可能性，但同時也指出它們能夠影響線粒體的鈣離子吸收。2010年，Perocchi等[14]利用鼠源多個組織線粒體基因組數(shù)據(jù)庫——MitoCarta和基因定位 (gene mapping)手段，篩選出了人源線粒體中一個影響線粒體鈣吸收的基因MICU1(mitochondrial calcium uptake 1)。有趣的是，此前已報道的人類自身過敏源 (human autoallergen)Hom s 4即為MICU1，它與遺傳性過敏皮炎 (atopic dermatitis)密切相關[64]。人源MICU1含有三種剪切形式，全長MICU1分子量為54 kDa且定位于線粒體內(nèi)膜上，具有一次跨膜螺旋和兩個鈣離子結(jié)合區(qū) (EF hand)，推測MICU1本身不能形成孔道，但具有調(diào)節(jié)MCU的功能[14]。隨后，Baughman等[44,66]和Stefani等[65,66]發(fā)現(xiàn)了存在于線粒體內(nèi)膜上、通過與MICU1相互作用而介導線粒體吸收鈣離子的MCU；MCU單體的大小為40 kDa，含有兩個跨膜螺旋，螺旋之間的連接處富含與鈣離子轉(zhuǎn)運相關的酸性氨基酸；根據(jù)非變性膠(native PAGE)結(jié)果，推測單體蛋白會以高聚的形式發(fā)揮鈣離子吸收功能。至此，人們才真正地找到了MCU的基因。隨后，Bick等[67]又分析了MICU1和MCU在不同物種中的分布情況，結(jié)果顯示兩者的關鍵區(qū)域在進化中非常保守。目前，關于MICU1在調(diào)節(jié)線粒體通過MCU吸收鈣離子過程中的具體作用，存在兩種相反的觀點。一方面，Perocchi等[14]的研究顯示MICU1的敲除會降低線粒體的基礎鈣離子水平，MICU1敲除的細胞中過表達MICU1會恢復線粒體的鈣離子吸收，這顯示MICU1起激活作用；然而，Mallilankaraman等[58]發(fā)現(xiàn)在線粒體內(nèi)低鈣離子濃度條件下，MICU1抑制MCU吸收鈣離子，從而維持線粒體基質(zhì)內(nèi)較低的基礎鈣離子濃度，這又表明 MICU1起抑制作用。在發(fā)現(xiàn)MICU1后，Mallilankaraman等[68]及Plovanich等[69]又鑒定出了其它具有調(diào)節(jié)MCU功能的新分子，包括MCUR1(mitochondrial calcium uniporter regulator 1)、MICU2(mitochondrial calcium uptake 2)及MICU3(mitochondrial calcium uptake 3)，它們能夠與MCU相互作用而調(diào)節(jié)鈣的吸收。這使得我們相信線粒體通過MCU吸收鈣離子是一個高度復雜并受精確調(diào)節(jié)的過程。

雖然目前已經(jīng)鑒定出了MCU及其部分調(diào)節(jié)蛋白的基因，但仍有諸多問題亟待回答，如：人源MCU具有3種剪切形式，擬南芥MCU也有6種剪切形式[70]，不同的剪切形式是否與MCU的組織特異性相關？MICU1～3的分布具有組織特異性[69]，不同組織的MCU活性是否與此相關？是否存在MCUR1及MICU1～3以外的調(diào)節(jié)蛋白？MCU轉(zhuǎn)運鈣的分子機理是什么，其轉(zhuǎn)運活性如何受到調(diào)節(jié)？VDAC是否與MCU相互作用來調(diào)節(jié)鈣吸收過程？UCP2/UPC3在線粒體鈣離子吸收過程中到底起什么作用？

依賴于RaM的快速線粒體鈣吸收

細胞內(nèi)的鈣信號通常是以鈣脈沖的形式出現(xiàn)，鈣脈沖峰值通常在1μmol/L。通過模擬細胞內(nèi)的鈣離子脈沖，可以測定鼠肝臟線粒體在不同鈣離子濃度下的鈣吸收曲線。結(jié)果表明，所有吸收曲線都很好地吻合單向吸收過程。然而，如果將吸收曲線的時間軸外推至零點，就會發(fā)現(xiàn)線粒體在每一個脈沖開始的短時間內(nèi)會吸收大量的鈣離子[71～73](圖2)；此吸收模式在哺乳類及鳥類的心臟、肝臟和大腦等組織中廣泛存在[10]。此外，估算發(fā)現(xiàn)，此吸收模式的速率為單向吸收的1000倍以上[74]，由此人們稱之為快速線粒體鈣吸收RaM。

和單向吸收過程一樣，RaM依賴于線粒體的內(nèi)膜電勢，可被解偶聯(lián)劑和釕紅等抑制(圖2)。此外，不同組織來源的線粒體的RaM存在差異性，特別是在抑制劑和激活劑方面[10,75]。

RaM可以被線粒體外高濃度的鈣離子所抑制，而當鈣離子濃度降低到一定值 (鼠肝臟線粒體為100 nmol/L)時，RaM就可以在短時間內(nèi)再次被激活[74]。因此，根據(jù)RaM具有轉(zhuǎn)運速率高、可以被低濃度鈣離子反復激活的特征，Gunter等[10]推測不處于鈣微區(qū)的線粒體在不能利用MCU單向吸收鈣離子的情況下，可以利用RaM調(diào)控ATP合成的速率，以滿足細胞的能量代謝需求。目前，RaM所依賴的分子機制研究進展緩慢，通過對比RaM與MCU抑制劑及其動力學過程，人們推測RaM可能為MCU的不同構象[10,58]。

依賴于線粒體雷諾丁受體的鈣吸收

雷諾丁受體 (ryanodine receptor，RyR)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)上負責將鈣離子釋放至胞漿中的一種鈣通道，且是已知最大的鈣通道 (>2MD)。目前已鑒定出三種雷諾丁剪切形式，分別是RyR1、2和3，它們會形成同源四聚體來行使通道功能[76]；三種剪切形式有著不同的藥理學特征和組織表達特異性[77]。相對于內(nèi)網(wǎng)上存在RyR的事實，線粒體內(nèi)膜 (嵴)上是否存在RyR目前仍處于爭論之中。利用免疫電鏡和免疫雜交等手段，Beutner等[78]發(fā)現(xiàn)存在一個600 kDa大小的線粒體雷諾丁受體mRyR定位在鼠心臟線粒體嵴上，且與RyR1相似；由于線粒體存在內(nèi)膜負電勢，Beutner等及其他研究組[80,81]認為mRyR在生理條件下行使線粒體鈣吸收功能，線粒體鈣過載時則會介導線粒體鈣的釋放，且其活性受胞漿內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。然而，Salnikov等[82]認為鼠心臟線粒體嵴上不存在mRyR。此外，Uehara等[83]報道在鼠脾臟靜脈竇上皮細胞線粒體嵴上也存在mRyR，并與RyR3相似。因此，是否存在mRyR還需要進一步的驗證。

MCU、RaM和mRyR的活性對鈣離子濃度的依賴是不同的——RaM在低鈣離子濃度下被激活，在高鈣離子濃度下被抑制；MCU在低鈣離子濃度下活性很低，在高鈣離子濃度下被激活；mRyR通道只有在一定的鈣離子濃度下才開放，并受到線粒體內(nèi)膜電勢調(diào)節(jié)。依據(jù)MCU、RaM和mRyR的吸收動力學特征，一種猜測認為——在鼠心臟線粒體鈣離子吸收的最初階段，鈣離子濃度較低，鈣離子吸收以RaM為主；當線粒體外鈣離子濃度逐漸升高時，RaM會被抑制而轉(zhuǎn)向以依賴mRyR和MCU為主的吸收[75,84](圖3)。但是，由于線粒體上是否存在mRyR還存在爭議，這個模型是否成立還值得商榷。

其他鈣吸收方式——人類心臟線粒體mCa1和mCa2電流

Michels等[85]于2009年通過膜片鉗技術鑒定出人類心肌細胞線粒體內(nèi)膜上的兩種鈣離子轉(zhuǎn)運通道電流——mCa1和mCa2。通過對其激活劑和抑制劑的研究，他們傾向于認為mCa1就是MCU形成的通道電流，而mCa2形成的機制目前尚不清楚。

線粒體的鈣離子釋放

由于線粒體的內(nèi)膜存在負電勢 (通常在－150～－180 mV之間)，其鈣離子的釋放必然是一個克服電化學梯度的過程。因此，鈣離子釋放過程需要與其他放能過程相偶聯(lián)。通常認為線粒體可以通過以下幾種方式釋放鈣離子：1)鈉離子依賴的鈣離子釋放 (mNCX)；2)鈉離子非依賴的鈣離子釋放 (NICE)；3)其他釋放方式：DAG激活的陽離子通道(DAG-activated cation-selective channel，DCC)和線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道 (mitochondrial permeability transition pore，mPTP)介導的鈣釋放。

鈉離子依賴的鈣離子釋放(mNCX)

mNCX主要存在于心臟、大腦、骨骼肌、腮腺等興奮組織，以及大多數(shù)癌癥組織中。mNCX介導Ca2+與Na+交換的過程中，Ca2+可以被Sr2+替代，Na+可以被Li+替代[86]。通過大量的研究，Brand等[31]認為mNCX介導Na+與Ca2+交換的過程中，Na+與Ca2+的比例為3而不是2。地爾硫卓、氯硝安定及苯并硫氮雜卓類化合物 (例如CGP37157)可以作為mNCX的抑制劑，其中，CGP37157最為常用[87]。但是，這些化合物的抑制效果具有細胞類型依賴性[6,12]。此外，鉀離子和質(zhì)子對mNCX也具有一定的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用依賴于膜電勢[86]。

與MCU相似，mNCX的分子機制研究也一直進展緩慢。1992年，Li等[88]從鼠心臟線粒體中分離出一種能夠介導鈉離子依賴的鈣離子釋放的、大小為110 kDa的蛋白。2004年，Paucek等[89]分離出了牛心線粒體中的Na+/Ca2+交換體。然而這些結(jié)果沒有得到重復。2004年，Cai等[90]通過對包括Na+/Ca2+的陽離子/鈣離子交換體超家族 (Cation/Ca2+exchanger)的生物信息學研究，發(fā)現(xiàn)了該超家族中的一個新基因。隨后，他們對該基因進行功能研究，發(fā)現(xiàn)它具有介導Na+/Ca2+交換的活性，且該活性依賴于鉀離子的存在，因此將其命名為NCKX6[91]。但是，Palty等[92]隨后發(fā)現(xiàn)NCKX6具有不依賴于鉀離子的Na+/Ca2+交換活性，且與mNCX一致的是，在交換過程中鋰離子可以替換鈉離子，因此，他們將其改稱為NCLX。2010年，Palty等[93]發(fā)現(xiàn)NCLX定位在線粒體嵴上，并能夠影響線粒體鈣的釋放。至此，人們推測NCLX可能就是線粒體mNXC的基因。

雖然已鑒定出線粒體mNCX的基因——NCLX，但目前關于NCLX的功能和結(jié)構研究很少[92,94]，存在許多亟待解決的問題。例如，鼠不同組織來源的NCLX蛋白表達水平的差異與相應組織的mNCX活性并不線性相關[91]，那么，不同組織，特別是興奮組織的mNCX活性是否與NCLX的蛋白翻譯后修飾有關？另一方面，NCLX是否只定位在線粒體上？Cai等[91]發(fā)現(xiàn)表達在HEK293中的鼠全長NCLX定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而截短體定位在質(zhì)膜上，但Palty等[93]發(fā)現(xiàn)NCLX只定位在線粒體內(nèi)膜上。此外，NCLX存在分子量為70 kDa和55 kDa兩種剪切形式，它們都具有Na+/Ca2+交換活性，這兩種剪切形式的生理意義是什么[92]？NCLX介導鈣釋放的分子機制是什么且與其它通道介導的Na+/Ca2+交換區(qū)別是什么？

鈉離子非依賴性的鈣離子釋放(NICE)

在發(fā)現(xiàn)mNCX的同時，研究者發(fā)現(xiàn)在肝臟、腎臟、肺和平滑肌等非興奮組織中存在鈉離子非依賴的鈣釋放途徑，即NICE。NICE除了能夠介導釋放Ca2+，還能夠釋放Sr2+、Ba2+和Mn2+。因此，人們認為NICE不僅僅是鈣離子釋放的方式，而是線粒體內(nèi)二價離子釋放的統(tǒng)一模式[86]。研究表明，NICE介導鈣離子釋放是一個電中性的過程——即它介導兩個H+和一個Ca2+的相對轉(zhuǎn)運，因此，人們認為NICE介導鈣離子釋放所需能量完全等價于質(zhì)子運輸過程中釋放的能量。但是，計算表明NICE釋放鈣所需的能量是質(zhì)子電化學梯度的3.5到47倍，因此推測 NICE介導鈣釋放的過程中還需要其他的能量來源[95]。據(jù)報道，NICE除了可以被一些氧化抑制劑和解偶聯(lián)劑抑制外，還可以被釕紅抑制[86]。

迄今為止，關于NICE的分子機制研究進展緩慢。1998年，Villa等[96]分離出鼠肝線粒體中一個66 kDa的H+/Ca2+交換體。但后續(xù)研究沒有重復出該結(jié)果。2009年，Jiang等[97]在果蠅和HeLa細胞線粒體中發(fā)現(xiàn)Letm1(leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1)可以介導H+/Ca2+交換，它可以在低鈣濃度下介導1個H+和1個Ca2+的交換。然而，Jiang等的研究僅觀察到Letm1介導線粒體鈣的吸收——HeLa細胞中過表達Letm1可以在激動劑誘導下使線粒體內(nèi)鈣離子濃度上升。相反的是，Waldeck等[98]發(fā)現(xiàn)增加上皮細胞內(nèi)線粒體外的鈣離子濃度時，過表達Letm1并不能使線粒體內(nèi)的鈣離子濃度上升。有趣的是，Dimmer等[99]發(fā)現(xiàn)在酵母細胞中敲除Letm1的同源基因Mdm38后，加入尼日利亞菌素(H+/K+交換體)可以使酵母恢復生長，由此他們推測Letm1是一個H+/K+交換體，而不是行使H+/Ca2+交換的功能[66]。

其他鈣離子釋放途徑

膜片鉗實驗研究發(fā)現(xiàn)，在人腦線粒體中，二酰基甘油 (diacyl glycerol，DAG)能夠激活對鑭敏感的陽離子通道，說明存在DAG激活的陽離子通道DCC(DAG-activated cation-selective channel)。雖然體內(nèi)實驗表明DCC能夠介導線粒體釋放鈣離子，但在DCC單獨重組的脂質(zhì)體實驗中，并沒有發(fā)現(xiàn)其具鈣轉(zhuǎn)運活性。結(jié)合電導和抑制劑實驗，研究者推測DCC參與的線粒體鈣離子釋放需要除DCC以外的其他分子參與[75,100]。

已有的動力學數(shù)據(jù)表明，線粒體內(nèi)膜上已知的鈣離子釋放途徑的釋放速率小于其吸收速率，因此，必然存在其他的鈣離子釋放途徑，以避免正常線粒體的鈣過載。有人認為線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道m(xù)PTP可以通過在短暫的開放和關閉之間進行跳躍 (Flicker)，來參與正常線粒體的鈣離子釋放[10]。但是，mPTP是否行使鈣離子釋放仍然是一個疑問——mPTP是一個高通量、低選擇性的激活孔道，它可以被高濃度鈣離子激活而開放；然而，當mPTP被持續(xù)性激活后就有可能導致細胞凋亡[9,101]。因此，研究者認為即使mPTP以Fliker形式參與正常線粒體的鈣釋放，它也需要精確的調(diào)控。

線粒體鈣離子吸收釋放與疾病

由于線粒體內(nèi)的鈣離子濃度會影響線粒體ATP的合成、線粒體mPTP的開放、細胞質(zhì)內(nèi)的鈣信號及胞漿鈣穩(wěn)態(tài)的維持。因此，保持正常的線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運能力具有重要生理意義，它的異常與許多重要疾病相關。

無論是在缺血/再灌流還是在缺氧/再供氧的情況下，肌細胞線粒體內(nèi)的鈣離子濃度都會增加，這或者增加心肌細胞能量的供應，或者導致心肌細胞的死亡。Griffth等[11]認為，在缺氧狀態(tài)下，心肌細胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度的增加是由于mNCX會逆轉(zhuǎn)而吸收鈣離子。Castaldo等[12]通過對大腦缺血、癲癇和老年癡呆情況下線粒體內(nèi)鈣離子的研究，發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)鈣離子濃度的變化與神經(jīng)細胞的存活密切相關。

在動物模型中使用線粒體鈣轉(zhuǎn)運抑制劑來觀察線粒體鈣轉(zhuǎn)運對生理功能的影響，發(fā)現(xiàn)不同種類抑制劑的使用具有細胞類型依賴性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，使用釕紅、釕360、地爾硫卓、氯硝安定和CGP37157等抑制劑并沒有得到理想的效果，有時甚至得到相反的效果[6,12]。因此，人們迫切希望解決線粒體鈣轉(zhuǎn)運的分子機制，以期獲得特異性的藥物來調(diào)控線粒體的鈣轉(zhuǎn)運。

結(jié) 語

鈣離子通過線粒體上的不同轉(zhuǎn)運機制穿梭于線粒體與細胞質(zhì)之間，調(diào)節(jié)線粒體乃至整個細胞的生理功能。近半個世紀以來，人們通過生化、電生理等方法研究了線粒體的各種鈣離子轉(zhuǎn)運途徑，獲得了它們的離子選擇特異性、激活劑/抑制劑、動力學、電導等多種特征，使我們對這些過程有了一定程度的認識。近年來，由于分子生物學和生物信息學等技術手段的發(fā)展與成熟，人們對這些鈣離子轉(zhuǎn)運途徑所依賴的分子基礎有了一定的認識。未來人們將通過結(jié)構生物學和生物化學等手段，對不同組織來源的、諸如MCU依賴的鈣離子單向吸收和鈉離子依賴的鈣離子釋放等過程的分子機制做出深入的揭示，從而豐富人們對線粒體鈣轉(zhuǎn)運平衡機制的認識。此外，由于MCU、MICU1、NCLX等線粒體鈣轉(zhuǎn)運基因的鑒定，線粒體鈣轉(zhuǎn)運的研究將從傳統(tǒng)的細胞水平轉(zhuǎn)向分子水平，從而更直接準確地闡釋線粒體鈣轉(zhuǎn)運的生理功能。同時，由于線粒體處于不斷融合分裂和沿細胞骨架運動的動態(tài)過程中，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜等細胞器在時空上存在著密切的關聯(lián)，因此，線粒體的鈣轉(zhuǎn)運必定與這些細胞器上的鈣轉(zhuǎn)運密切相關并相互作用和影響，這也將成為下一步的研究重點。

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