蔡晶晶 王洪榮 付 聰 李志騰 朱婧靚

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

反芻動(dòng)物的瘤胃能夠合成硫胺素、核黃素、煙酸、葉酸、生物素等B族維生素，B族維生素主要以輔酶形式催化蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪代謝中的各種反應(yīng)，對(duì)反芻動(dòng)物的正常生命活動(dòng)具有重要意義。其中硫胺素在反芻動(dòng)物碳水化合物代謝中具有重要作用，過去研究認(rèn)為幼齡反芻動(dòng)物(0～4月齡)因瘤胃功能發(fā)育尚不完全需要補(bǔ)充硫胺素，而成年反芻動(dòng)物因其瘤胃微生物能夠合成充足的硫胺素以滿足自身的營養(yǎng)需要［1］，在飼糧中不需要添加。但近年來為提高生產(chǎn)效益而采用集約化、規(guī)?；⒏呔暳系娘曫B(yǎng)模式，導(dǎo)致亞急性瘤胃酸中毒(SARA)等營養(yǎng)性代謝疾病發(fā)病率的升高，而防治SARA的傳統(tǒng)措施是添加碳酸氫鈉等緩沖劑來中和有機(jī)酸，以及添加離子類載體抗生素如莫能菌素等以降低瘤胃中乳酸和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的產(chǎn)生。但碳酸鹽只能在短時(shí)間內(nèi)起到緩解酸中毒的作用，而抗生素由于藥物的殘留問題，被逐漸禁用［2］。因此尋求一種安全高效的緩解瘤胃酸中毒的物質(zhì)具有深遠(yuǎn)的意義。最近研究表明，硫胺素代謝與瘤胃酸中毒的發(fā)生關(guān)系密切。張紅偉［3］研究山羊體外高精飼料飼糧條件下添加硫胺素對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)硫胺素可以提高瘤胃液pH，顯著降低瘤胃液乳酸濃度和乙酸比例。董淑紅［4］研究硫胺素對(duì)SARA狀態(tài)下山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響，結(jié)果表明，飼糧中添加硫胺素以后，瘤胃液pH顯著升高，乳酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度有下降趨勢，瘤胃液和血液中的組胺和內(nèi)毒素濃度有下降趨勢。在臨床上也有皮下注射硫胺素制劑作為治療瘤胃酸中毒輔助方法的報(bào)道。目前，硫胺素對(duì)山羊瘤胃酸中毒關(guān)系的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，然而關(guān)于硫胺素對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵的影響及對(duì)高精飼料飼養(yǎng)條件導(dǎo)致的瘤胃酸中毒關(guān)系的研究報(bào)道甚少。本試驗(yàn)旨在研究不同非纖維性碳水化合物和中性洗滌纖維比(NFC/NDF)飼糧對(duì)荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響，在荷斯坦奶牛發(fā)生SARA的狀態(tài)下，研究添加硫胺素對(duì)SARA的緩解作用，探討硫胺素應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用硫胺素為鹽酸鹽硫胺素(thiamine hydrochloride)，由美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，試劑級(jí)，有效成分含量≥99%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

從揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀鲞x取3頭身體健康、體重接近且安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.3 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

設(shè)計(jì)3種試驗(yàn)飼糧，A組、B組和C組分別飼喂 NFC/NDF為1.41(精粗比 5∶5)、NFC/NDF 為2.01(精粗比 7∶3)、NFC/NDF 為 2.01(精粗比7∶3)+180 mg/kg硫胺素的試驗(yàn)飼糧。硫胺素以鹽酸硫胺素的形式添加(添加劑量的篩選主要依據(jù)于本課題組前期體外培養(yǎng)中硫胺素添加量的試驗(yàn)結(jié)果［5］)。每日08:00和20:00分2次等量飼喂，自由飲水，常規(guī)光照和管理。精飼料組成見表1，硫胺素添加量、試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3×3完全拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)，試驗(yàn)持續(xù)69 d，分3期進(jìn)行，每期23 d，每期中預(yù)試期20 d，正試期 3 d。

1.5 瘤胃液樣品的采集

采樣時(shí)間為飼喂后的 0、3、6、9 和 12 h，將瘤胃食糜經(jīng)4層紗布過濾，采集新鮮瘤胃液立即測定pH，然后將瘤胃液分裝于10 mL離心管中，將樣品置于-20℃冰箱中冷凍保存，以備測定其他內(nèi)環(huán)境指標(biāo)。

表1 精飼料組成(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition of the concentrate(air-dry basis) %

1.6 測定指標(biāo)、方法及主要的儀器

1.6.1 pH

瘤胃液pH使用雷磁pHS-3C型pH計(jì)測定。

1.6.2 NH3-N濃度

瘤胃液NH3-N濃度使用水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法［6］測定。

1.6.3 乳酸濃度

瘤胃液乳酸濃度使用對(duì)羥基聯(lián)苯法［7］測定。

1.6.4 VFA濃度

瘤胃液經(jīng)10 000×g離心10 min后，取上清1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混勻后10 000×g離心10 min，取上清液用0.45μm的水系濾膜過濾，取過濾后的上清液0.4μL用日本島津GC-9A氣相色譜儀［8］測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)用 Excel初步整理后，采用SPSS 16.0軟件中的one-way ANOVE進(jìn)行方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液p H的影響

由表4可知，瘺管牛在采食結(jié)束后瘤胃液pH逐漸降到最低點(diǎn)，隨后由于瘤胃本身的緩沖能力，pH逐漸上升至第2次采食后又出現(xiàn)類似的變化趨勢。不同飼糧條件下，pH隨采樣時(shí)間點(diǎn)的變化都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。A組的pH在6 h顯著低于其他采樣時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)，在采食后的6 h內(nèi)B組在不同時(shí)間點(diǎn)的pH都差異顯著(P＜0.05)，C組在0和12 h的pH 高于3、6和9 h，差異顯著(P＜0.05)。

隨著飼糧NFC/NDF的增加，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)B組瘤胃液pH與A組相比顯著降低(P＜0.05)。飼糧中添加硫胺素以后，C組各時(shí)間點(diǎn)瘤胃液pH與B組相比有升高趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。

表2 硫胺素添加量、試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Thiamin supplemental level，and composition and nutrient levels of trial diets(DM basis) %

表3 拉丁方設(shè)計(jì)Table 3 The Latin square design

2.2 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液NH3-N濃度的影響

由表5可知，各組NH3-N濃度變化趨勢相似，總體呈隨著發(fā)酵時(shí)間的延長先升高后下降的趨勢，均在采食后3 h達(dá)最高。A組在采食后的6、9和12 h的NH3-N濃度差異不顯著(P＞0.05)，顯著低于采食后0和3 h的NH3-N濃度(P＜0.05)。B組的NH3-N濃度在采食后6和9 h無顯著變化(P＞0.05)，其他各時(shí)間點(diǎn)間均存在顯著差異(P＜0.05)。C組的NH3-N濃度在0和3 h不存在顯著差異(P＞0.05)，在6 h顯著降低(P＜0.05)，在9和12 h持續(xù)降低，與前3個(gè)時(shí)間點(diǎn)存在顯著差異(P＜0.05)。

隨著飼糧NFC/NDF的增加，B組和A組相比，各時(shí)間點(diǎn)NH3-N濃度均顯著或極顯著上升(P＜0.05或P＜0.01)。飼糧添加硫胺素后，C組和B組相比，各時(shí)間點(diǎn)NH3-N濃度均顯著降低(P＜0.05)。

表4 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液p H的影響Table 4 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on rumen fluid pH in dairy cows

表5 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液NH3-N濃度的影響Table 5 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on rumen fluid NH3-N concentration in dairy cows mg/dL

2.3 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液乳酸濃度的影響

由表6可知，各組乳酸濃度變化趨勢相似，采食后出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。A組乳酸濃度在0、3、6、9 h 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均差異顯著(P ＜0.05);B組在飼喂后的3 h乳酸濃度達(dá)最高，顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)，不同時(shí)間點(diǎn)之間變化的幅度和范圍較大;添加硫胺素的C組在采食后6 h乳酸濃度較3 h顯著降低(P＜0.05)，9和12 h進(jìn)一步顯著降低(P＜0.05)，而這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著(P＞0.05)。

隨著飼糧NFC/NDF的增加，0和9 h時(shí)，B組乳酸濃度與A組相比極顯著上升(P＜0.01)，在3、6和12 h，則呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P＜0.05)。飼糧添加硫胺素后，C組和B組相比，9 h時(shí)乳酸濃度極顯著降低(P＜0.01)，其他各時(shí)間點(diǎn)乳酸濃度均顯著降低(P＜0.05)。

2.4 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液VFA濃度和比例的影響

由表7可知，隨著瘤胃內(nèi)發(fā)酵時(shí)間的延長，A組的乙酸、丙酸和丁酸比例及乙酸/丙酸受不同采樣時(shí)間點(diǎn)的影響較小，TVFA濃度先升高后降低，3、6、9 h變化顯著(P ＜0.05)，而 12 h恢復(fù)到 0 h時(shí)的水平;B組乙酸比例和乙酸/丙酸呈現(xiàn)先降低在升高再降低的趨勢，丙酸、丁酸比例和TVFA濃度呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢;C組在采食后3 h，乙酸比例和乙酸/丙酸較0 h顯著降低(P＜0.05)，而丙酸比例和TVFA濃度顯著升高(P＜0.05)。

飼糧NFC/NDF的增加，B組與A組相比，乙酸比例極顯著降低(P＜0.01)，丙酸和丁酸比例顯著或極顯著上升(P＜0.05或P＜0.01)，乙酸/丙酸顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，TVFA濃度除0 h無顯著差異(P＞0.05)外，其他各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.05)。飼糧中添加硫胺素后，C組與B組相比，乙酸比例顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，丙酸比例顯著或極顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，丁酸比例采食6 h后呈現(xiàn)降低的趨勢，差異不顯著(P＞0.05)，乙酸/丙酸顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，TVFA濃度除了6和9 h顯著降低外，其他時(shí)間點(diǎn)無顯著變化(P＞0.05)。

表6 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液乳酸濃度的影響Table 6 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on rumen fluid lactic acid concentration in dairy cows mmol/L

表7 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液VFA濃度和比例的影響Table 7 Effects of different dietary NFC/NDF and thiamine on concentration and proportion of rumen fluid VFA in dairy cows

3 討論

3.1 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液p H的影響

pH是瘤胃內(nèi)重要的生理指標(biāo)，瘤胃酸度對(duì)維持瘤胃內(nèi)環(huán)境相對(duì)恒定具有主導(dǎo)作用，維持pH在正常范圍內(nèi)是保證瘤胃正常發(fā)酵的前提條件之一。在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)過程中，飼糧水平、飼喂方法、咀嚼、唾液分泌及瘤胃內(nèi)乳酸及VFA等其他有機(jī)酸和NH3-N的生成、吸收和排除等因素均會(huì)影響瘤胃液的pH［9-10］，但引起瘤胃液pH波動(dòng)的根本原因是飼糧結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)水平［11］。反芻動(dòng)物采食后，飼糧中的NFC快速發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸降低瘤胃液pH，但隨后有機(jī)酸被微生物利用進(jìn)入真胃或被瘤胃壁吸收，有機(jī)酸濃度又逐漸下降，使得pH在采食后呈現(xiàn)先降低再上升的變化趨勢。

目前，瘤胃液的pH是判定反芻動(dòng)物酸中毒及區(qū)分急性與亞急性瘤胃酸中毒常用的指標(biāo)［12］。有學(xué)者認(rèn)為瘤胃液pH低于5.8時(shí)，纖維素分解菌活性下降，基于這種考慮，Yang等［13］將5.8作為判定SARA發(fā)生的閾值。Penner等［14］僅根據(jù)瘤胃的pH將瘤胃酸中毒劃分為輕度酸中毒(5.5≤pH＜5.8)、中度酸中毒(5.2≤pH＜5.5)及急性酸中毒(pH＜5.2)3種情況。本試驗(yàn)中飼喂飼糧NFC/NDF為2.01的瘺管牛，瘤胃液pH介于5.41～5.96波動(dòng)，認(rèn)為已經(jīng)處于SARA的狀態(tài)。在飼糧中添加180 mg/kg的硫胺素，結(jié)果表明，添加硫胺素可以提高瘤胃液pH，但與正常狀態(tài)下奶牛瘤胃液pH比較，仍存在顯著差異，只是在一定程度上緩解瘤胃的酸性環(huán)境，降低SARA對(duì)機(jī)體的損害，但是卻不能完全避免SARA對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響。

3.2 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液NH3-N濃度的影響

瘤胃微生物的生長需要多種營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，其中碳源和氮源是保證微生物生長最重要的營養(yǎng)素，在有能量和碳源的情況下，瘤胃內(nèi)NH3-N是微生物合成菌體蛋白質(zhì)的主要氮源。瘤胃內(nèi)NH3-N濃度是瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要參數(shù)，NH3-N濃度主要受到飼料蛋白質(zhì)可溶性、唾液內(nèi)尿素量、氮在瘤胃內(nèi)的吸收利用、微生物的利用和瘤胃食糜進(jìn)入后消化道的影響，一定程度上反映出微生物對(duì)飼糧蛋白質(zhì)的降解程度及微生物種群利用氨態(tài)氮的能力。如果NH3-N濃度過高，則說明瘤胃微生物降解氮源釋放氨氣的速率超過微生物合成菌體蛋白的速率，這樣就增加了氮循環(huán)中氮素的損失，但是NH3-N濃度過低又會(huì)限制瘤胃微生物合成菌體蛋白［15］。

很多研究表明，早晨飼喂反芻動(dòng)物后，瘤胃內(nèi)微生物生長需要的營養(yǎng)成分濃度升高，各種微生物快速增殖，加速了飼糧中蛋白質(zhì)的降解速度，使得NH3-N濃度上升，隨著氨被微生物吸收利用，NH3-N濃度逐漸下降并趨于平緩，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果是一致的。B組飼糧NFC/NDF高于A組，為瘤胃微生物生長提供了充足的能量，使得微生物活性增強(qiáng)及蛋白質(zhì)降解能力提高，因此B組NH3-N濃度高于A組。飼糧添加硫胺素的C組的NH3-N濃度低于未添加的B組，說明添加硫胺素能夠促進(jìn)微生物對(duì)氨的利用，提高菌體蛋白的產(chǎn)量。

3.3 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液乳酸濃度的影響

段得賢等［16］研究認(rèn)為，在正常瘤胃發(fā)酵狀態(tài)下，乳酸不是瘤胃發(fā)酵的重要中間產(chǎn)物，也不能被瘤胃壁吸收。但許多研究已經(jīng)證實(shí)，瘤胃發(fā)酵異常時(shí)，瘤胃內(nèi)乳酸濃度增加是急性酸中毒產(chǎn)生的直接原因，但在SARA發(fā)病中乳酸的作用卻無定論。Keunen等［17］研究表明，反芻動(dòng)物發(fā)生SARA時(shí)瘤胃內(nèi)的乳酸濃度不會(huì)超過10 mmol/L。Beauchemin等［18］認(rèn)為發(fā)生瘤胃 SARA時(shí)瘤胃內(nèi)根本不存在乳酸。Plaizier等［19］研究發(fā)現(xiàn)，奶牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒時(shí)乳酸濃度在0.45～0.74 mmol/L的范圍內(nèi)變化。胡紅蓮［20］研究表明，山羊在發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒時(shí)，乳酸含量較低，在全程內(nèi)均低于1 mmol/L?；加衼喖毙粤鑫杆嶂卸镜膭?dòng)物，其患病時(shí)間、病情的嚴(yán)重程度等都有可能造成乳酸濃度數(shù)值上的差異，測定對(duì)象正常指標(biāo)之間具有的差異性、測定方法等對(duì)數(shù)值的差異也會(huì)有一定影響，也會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)誤差的存在。

在本試驗(yàn)中隨著飼糧NFC/NDF的增加，B組的乳酸濃度高于A組，飼糧添加硫胺素后，C組的乳酸濃度與A組相比仍存在顯著差異，說明添加硫胺素能降低乳酸濃度，但不能完全降至正常飼糧所能產(chǎn)生的乳酸水平。其中硫胺素可能是促進(jìn)了乳酸利用菌對(duì)乳酸的利用，進(jìn)而導(dǎo)致乳酸濃度降低，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

3.4 不同NFC/NDF飼糧和硫胺素對(duì)奶牛瘤胃液VFA濃度和比例的影響

VFA中的乙酸、丙酸、丁酸是瘤胃中碳水化合物發(fā)酵的主要終產(chǎn)物，可提供反芻動(dòng)物總能量需要的70% ～80%，同時(shí)也是顯示瘤胃發(fā)酵、消化等代謝活動(dòng)狀況的重要指標(biāo)之一。乙酸在體內(nèi)主要通過乙酰輔酶A在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的作用下合成體脂和乳脂，在體內(nèi)儲(chǔ)存能量并提高乳脂率，少部分的乙酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)循環(huán)生成水和二氧化碳，釋放ATP供能。丙酸作為生糖前體，在肝臟合成糖原，也可合成少量乳酸。丁酸以β-羥丁酸的形式在乳腺組織和肝臟中參與體內(nèi)物質(zhì)代謝，也可作為肌肉組織來源。影響瘤胃中VFA濃度和比例的因素很多，但其中最根本的原因是飼糧的結(jié)構(gòu)問題。當(dāng)精粗比發(fā)生改變時(shí)，瘤胃液中各種VFA的比例也會(huì)發(fā)生變化，這是由于淀粉分解菌和纖維素分解菌隨飼糧類型的不同，其優(yōu)勢菌所占比例發(fā)生改變。一般來說，粗飼料在瘤胃中產(chǎn)生高比例乙酸，而精飼料則產(chǎn)生高比例丙酸。

正常情況下，隨著采食時(shí)間的推移，采食后瘤胃內(nèi)微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的VFA，隨后瘤胃微生物利用和瘤胃壁吸收同步進(jìn)行，VFA的濃度又會(huì)下降。本研究得出，隨著飼糧NFC/NDF的增加，丙酸和丁酸的比例呈現(xiàn)遞增趨勢，而乙酸比例、乙酸/丙酸呈現(xiàn)降低趨勢，這與王吉峰等［21］的研究結(jié)果一致。但TVFA的濃度卻呈下降趨勢，這與諸多學(xué)者如胡紅蓮［20］和 Ghorbani等［22］的研究結(jié)果報(bào)道不一致?？赡苁且?yàn)榍捌陲曃勾诛暳媳壤^高，纖維素和半纖維素產(chǎn)生的乙酸含量高，而在酸中毒比較嚴(yán)重的階段，奶牛的采食量顯著下降，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生的 VFA含量下降，這與董淑紅［4］以70%精飼料水平飼喂奶山羊時(shí)TVFA濃度出現(xiàn)下降結(jié)果一致。飼糧中添加硫胺素，乙酸比例、乙酸/丙酸呈現(xiàn)降低的趨勢，丙酸、丁酸比例呈現(xiàn)上升趨勢，這與董淑紅［4］研究結(jié)果一致。奶牛患有SARA是由于瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的過量VFA超過瘤胃絨毛的吸收能力造成的，VFA在瘤胃內(nèi)蓄積則pH降低［23］。添加硫胺素在一定程度上降低了TVFA在瘤胃內(nèi)的蓄積。添加硫胺素能夠改變瘤胃的發(fā)酵方向，使得VFA的組分比例發(fā)生變化，促進(jìn)丙酸合成，減少乙酸的生成，而丙酸是體脂合成的重要碳素來源，也是合成葡萄糖的前體(丙酸在反芻動(dòng)物體內(nèi)可以提供50%的葡萄糖來源)。

4 結(jié)論

①誘導(dǎo)奶牛發(fā)生SARA過程中，pH下降速率和幅度隨之增大，NH3-N濃度顯著上升，乳酸濃度顯著升高，乙酸比例、乙酸/丙酸呈現(xiàn)下降趨勢，丙酸和丁酸比例呈現(xiàn)升高的趨勢。

②飼糧中添加180 mg/kg硫胺素能夠緩解SARA，但不能完全消除酸中毒對(duì)機(jī)體的損害。

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