劉莉莉，白 云，李慶章

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

乳腺是哺乳動物分泌乳汁器官，泌乳階段乳汁中糖、脂肪和蛋白質(zhì)含量受母體、環(huán)境、食物等多種因素影響，其中營養(yǎng)是個主要調(diào)控因素[1]。乳脂肪是主要的能量物質(zhì)，在乳腺合成和分泌乳脂的過程中，乳腺上皮細(xì)胞生脂基因的表達(dá)受相關(guān)營養(yǎng)素的調(diào)節(jié)[2-4]。

脂肪酸是重要營養(yǎng)物質(zhì)，在生命活動中發(fā)揮重要作用，是生物體的能量來源和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分，還可通過細(xì)胞膜受體信號途徑、轉(zhuǎn)錄因子活化途徑等獨立、間接或直接地調(diào)控基因表達(dá)[5-7]。有研究報道長鏈脂肪酸（LCFA）能改變小鼠乳腺脂肪酸從頭合成基因、甘油三酯合成基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因及其他生脂基因表達(dá)[8-9]。國內(nèi)外關(guān)于中、短鏈脂肪酸對小鼠乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)研究很少。辛酸鈉是八碳飽和脂肪酸（C8:0），屬于典型的中鏈脂肪酸，本研究以小鼠乳腺上皮細(xì)胞為模型，檢測添加不同濃度的辛酸鈉對細(xì)胞活力、增殖能力及甘油三酯合成能力影響；檢測辛酸鈉對甘油三酯合成關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶（GPAM）、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6（AGPAT6）、二酰甘油脂酰轉(zhuǎn)移酶1（DGAT1）及對乳脂合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）基因表達(dá)的影響，旨在為深入研究脂肪酸對小鼠乳脂合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠乳腺上皮細(xì)胞，胎牛血清（Gibco），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco），辛酸鈉（Sigma），胰蛋白酶（Sigma），去除脂肪酸的牛血清白蛋白（Sigma），甘油三酯定量試劑盒（均購自普利萊基因技術(shù)有限公司）；CASY?ton緩沖液（購自德國Scharfe公司）；GPAMAntibody（sc-161674），AGPAT6 Antibody（sc-68594），DGAT1 Antibody（sc-32861），SREBP1 Anti?body（sc-365513），PPARγ Antibody（ab19481）。

1.2 小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

采用生長培養(yǎng)基（DMEM/F12＋10%FBS）于37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細(xì)胞，每隔24 h更換培養(yǎng)基。

1.3 小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖能力檢測

收集對數(shù)生長期小鼠乳腺上皮細(xì)胞等密度接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無脂無血清培養(yǎng)基（DMEM/F12+1 g·L-1BSA）培養(yǎng)24 h，更換新鮮無脂無血清培養(yǎng)基并添加不同濃度辛酸鈉，辛酸鈉終濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mmol· L-1，每組3個平行，培養(yǎng)48 h。消化不同處理組的小鼠乳腺上皮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液加入裝有10 mL CASY?ton緩沖液的CASY?杯（對細(xì)胞懸液進(jìn)行100倍稀釋），顛倒CASY?杯使細(xì)胞混勻，利用CASY細(xì)胞活力分析儀檢測細(xì)胞活力和增殖能力。

1.4 小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中甘油三酯濃度的檢測

取對數(shù)生長期乳腺上皮細(xì)胞等密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無脂無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，更換新鮮無脂無血清培養(yǎng)基，并添加不同濃度的辛酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其中辛酸鈉的添加濃度根據(jù)細(xì)胞活力和增殖能力的試驗結(jié)果，選擇使細(xì)胞生長增殖不受抑制的辛酸鈉濃度，采用甘油三酯定量試劑盒測定培養(yǎng)基中甘油三酯的濃度。

1.5 小鼠乳腺上皮細(xì)胞總蛋白提取

小鼠乳腺上皮細(xì)胞的處理及辛酸鈉的添加濃度同1.4。4℃預(yù)冷的D-HankS洗滌細(xì)胞2次；每孔中加100 μL 2×SDS Sample Buffer，用槍頭輕輕刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到0.5 mL的EP管中；100℃煮沸10 min使蛋白變性；超聲波破碎，15 s 3次，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western Blotting檢測

配制濃縮膠和分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。室溫用脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，取出后TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃搖床孵育1 h，TBST洗3次，發(fā)光液顯色，在暗室中曝光、顯影。采用Band Scan 5.0軟件對Western blotting圖譜進(jìn)行灰度掃描，X光膠片上蛋白條帶經(jīng)掃描讀取密度值后，與由同一轉(zhuǎn)移膜所測得的βactin蛋白比較得出蛋白的相對含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖能力的影響

圖1為不同濃度的辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖能力的影響。由圖1可見，小鼠乳腺上皮細(xì)胞添加濃度為0.25～1.00 mmol·L-1辛酸鈉時，各處理組與對照組相比細(xì)胞活力和增殖能力無顯著性差異（P＞0.05）；而添加2.00～8.00 mmol· L-1辛酸鈉，細(xì)胞活力和增殖能力與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，較高劑量2.00、4.00、8.00 mmol·L-1辛酸鈉顯著抑制細(xì)胞活力和增殖能力。

圖1 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖能力的影響Fig.1 Effects of sodium octanoate on cell viability and proliferarion ability of MMECs

根據(jù)不同濃度的辛酸鈉處理后各組細(xì)胞活力和增殖能力的試驗結(jié)果，本研究選擇添加對細(xì)胞生長增殖不受抑制即對細(xì)胞無毒性的辛酸鈉濃度（0～1.00 mmol·L-1的辛酸鈉），研究辛酸鈉對細(xì)胞甘油三酯合成能力和對乳脂合成關(guān)鍵酶以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子蛋白表達(dá)影響。

2.2 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞合成甘油三酯能力的影響

根據(jù)檢測細(xì)胞活力和增殖能力試驗結(jié)果，選擇0.25～1.00 mmol·L-1辛酸鈉處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞，采用甘油三酯測試盒測定培養(yǎng)基中TAG的濃度。結(jié)果如圖2所示，與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.25～1.00 mmol·L-1辛酸鈉以濃度依賴的方式顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中TAG濃度（P＜0.05）。

2.3 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting檢測不同濃度辛酸鈉處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞后，甘油三酯合成關(guān)鍵酶GPAM、AGPAT6、DGAT1和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SREBP1、PPARγ各蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。

2.3.1 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成關(guān)鍵酶表達(dá)的影響

如圖4所示，與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.25～1.00 mmol·L-1辛酸鈉以濃度依賴的方式降低或顯著降低（P＜0.05）細(xì)胞GPAM、AGPAT6和DGAT1的蛋白表達(dá)。

圖2 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞合成TAG能力的影響Fig.2 Effects of sodium octanoate on triacylglycerol synthesis of MMECs

圖3 辛酸鈉處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果Fig.3 Western blotting result about effects of sodium octanoate on related protein expression in milk fat synthesis of MMECs

圖4 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成關(guān)鍵酶表達(dá)的影響Fig.4 Effects of sodium octanoate on key enzymes of triacylglycerol synthesis of MMECs

2.3.2 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組乳腺上皮細(xì)胞相比，0.25～1.00 mmol·L-1辛酸鈉以濃度依賴的方式顯著降低細(xì)胞SREBP1和PPARγ的蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

圖5 辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響Fig.5 Effects of sodium octanoate on transcriptional regulatory factors of milk fat synthesis of MMECs

3 討論與結(jié)論

脂肪酸是哺乳動物乳腺攝取的重要營養(yǎng)物，對乳腺上皮細(xì)胞的生長增殖具有一定作用。齊利枝等研究發(fā)現(xiàn)低濃度的乙酸可提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性，高濃度乙酸則抑制細(xì)胞活性[10]。崔瑞蓮等證實較高濃度（200 μmol· L-1和400 μmol·L-1）的硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸能抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖[11]。本研究發(fā)現(xiàn)較高劑量（即2.00、4.00和8.00 mmol· L-1）辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖能力具有抑制作用。但辛酸鈉對其細(xì)胞活力和增殖能力影響的具體機(jī)理有待深入研究。本試驗通過CASY細(xì)胞活力分析儀檢測不同濃度的辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞活力的影響，確定辛酸鈉對小鼠乳腺上皮細(xì)胞無毒添加劑量作為后續(xù)試驗濃度添加范圍，即0～1.00 mmol·L-1辛酸鈉。

哺乳動物乳腺上皮細(xì)胞是乳脂合成場所，合成乳脂約95%為甘油三酯[12]。乳腺中GPAM、AG?PAT6和DGAT1酶主要參與催化甘油三酯合成。其中GPAM酶催化甘油三酯合成的第1步即脂酰輔酶A結(jié)合到3-磷酸甘油的sn-1位，AGPAT6酶催化第2個脂酰輔酶A結(jié)合到3-磷酸甘油的sn-2位，第3個脂酰輔酶A通過DGAT1酶的催化酯化到甘油骨架的sn-3位合成甘油三酯[13-14]。Bionaz等提出轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SREBP1和PPARγ在奶牛乳脂合成和分泌的基因網(wǎng)絡(luò)中具主導(dǎo)作用，其可調(diào)控多數(shù)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)[14]。Anderson等研究表明SREBP1對調(diào)節(jié)鼠乳脂合成起樞紐作用[15]；Wan等發(fā)現(xiàn)PPARγ敲除的小鼠減少TAG合成[16]。研究報道辛酸鹽能抑制脂肪細(xì)胞甘油三酯合成，抑制PPARγ、SREBP-1及其他生脂基因的表達(dá)[17-19]。研究表明，辛酸鹽能參與脂肪細(xì)胞的脂肪合成，并調(diào)節(jié)相關(guān)生脂基因表達(dá)。辛酸鹽對小鼠乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成及對甘油三酯合成關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PPARγ和SREBP1的影響卻不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，外源添加0.25～1.00 mmol·L-1辛酸鈉以濃度依賴的方式顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中甘油三酯的含量，說明辛酸鈉能抑制小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成。同時發(fā)現(xiàn)辛酸鈉也能以濃度依賴的方式降低或者顯著降低GPAM、AGPAT6、DGAT1及SREBP1、PPARγ蛋白表達(dá)，推測辛酸鈉可通過降低小鼠乳脂合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP1和PPARγ的表達(dá)，抑制其下游靶基因GPAM、AG?PAT6和DGAT1表達(dá).本研究檢測到小鼠乳腺上皮細(xì)胞中SREBP1和PPARγ的其他靶基因表達(dá)也顯著降低（材料未發(fā)表）。推測小鼠乳腺上皮細(xì)胞中辛酸鈉通過降低SREBP1和PPARγ的表達(dá)進(jìn)而抑制甘油三酯合成。這與前人用辛酸鹽對其他細(xì)胞脂肪合成影響研究[17-19]基本一致。

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