姜勛平，王黨偉，韓燕國，張晉瑋，劉桂瓊

（華中農(nóng)業(yè)大學動物科技動物醫(yī)學院，武漢 430070）

近年來，雜種優(yōu)勢在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應用，目前研究主要集中于動物生長和繁殖性能方面[1]。分子標記雜合性與動物經(jīng)濟性狀間的關聯(lián)性研究已有大量報道[2-4]，但基因雜合度對動物血液影響方面研究報道較少。動物血液是機體重要的內(nèi)環(huán)境，直接參與機體的新陳代謝、免疫應激等復雜的生理生化過程[5-6]。血液生化指標受遺傳因素影響，從分子水平上對血液生化指標進行比較分析具有一定的探索意義，本研究用SNP標記估測個體基因雜合度，比較不同個體基因雜合度水平下血液生化指標的差異，為探索個體基因雜合度對湖北烏羊血液生化指標的影響提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗羊均為1.5到2周歲健康無病的湖北烏羊，共計107只，選自湖北省通山縣湖北烏羊繁育基地羊群，自由放牧，夜晚補加精料，自由飲水。

1.2 血樣采集及血液生化指標測定

清晨空腹頸靜脈采血，使用一次性血液采集針，采集血液7 mL分兩管，其中4 mL置于37℃水浴自然凝血后，3 500 r·min-1離心分離出血清，立即帶回實驗室在12 h內(nèi)完成各項生化指標的測定，3 mL血液按照文獻[7]提取DNA。

用羅氏P800全自動生化分析儀MODULAR-PE（瑞士）對如下生化指標進行測定：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Al?anine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspar?tate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、總蛋白（Total protein，TP）、白 蛋 白（Albumin，ALB）、 球 蛋 白（Globulin，GLOB）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、磷酸肌酸激酶（Creatine ki?nase，CK）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）。其中，ALP，CK與LDH使用上海羅氏制藥有限公司試劑盒測定；ALT、ALP，TG和TC使用中生北控生物科技股份有限公司的試劑盒測定；TP，GLOB使用長春匯力生物技術有限公司的試劑盒測定，具體操作方法按照相應試劑盒推薦的程序完成。

1.3 SNP的篩選及基因分型結(jié)果

1.3.1 SNP引物信息

根據(jù)已發(fā)表文獻中的研究成果及本實驗室的積累，收集整理SNP位點，在湖北烏羊群體中進行掃描并基因分型，由于某些標記可能與湖北烏羊血液生化指標存在相關，因此先統(tǒng)計分析各標記基因型間是否存在差異，如果有則棄之，最終選取13個SNP標記（見表1）來對湖北烏羊進行雜合度進行統(tǒng)計。

表1 13個SNP的相關信息Table1 Informmation of 13 SNP sites

1.3.2 基因分型結(jié)果

本試驗所選的13個SNP標記位點之中，8個采用PCR-SSCP分型，6個采取PCR-RFLP分型，現(xiàn)各選取兩個PCR-SSCP分型位點和兩個PCR-RFLP分型位點結(jié)果作為代表。如圖1所示，圖1為IGF-Ⅰ基因部分擴增片段，其長度為363 bp，利用HaeⅢ內(nèi)切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)3種基因型，3條帶的為363 bp-264 bp-99 bp雜合子個體；圖2為Mc1R基因部分擴增片段，其長度為167bp，利用HaeⅢ內(nèi)切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)三種基因型，3條帶的為167 bp-121 bp-46 bp雜合子個體；圖3、圖4分別為Myf5和INHβA基因部分擴增片段，其中PCR-SSCP電泳圖中3條帶的均為雜合子個體。

圖1 IGF-1基因多態(tài)位點瓊脂糖及PCR-RFLP電泳圖Fig.1 Mutation of IGF-1:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of Primer IGF-1 and PCR-RFLP results

圖2 Mc1R基因多態(tài)位點瓊脂糖及PCR-RFLP電泳圖Fig.2 Mutation of Mc1R:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of Primer Mc1R and PCR-RFLP results

圖3 Myf5基因多態(tài)位點瓊脂糖及PCR-SSCP電泳圖Fig.3 Mutation of Myf5:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of PrimerMyf5and PCR-SSCP results

圖4 INHβA基因多態(tài)位點瓊脂糖及PCR-SSCP電泳圖Fig.4 Mutation of INHβA:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of PrimerINHβAand PCR-SSCP results

1.4 統(tǒng)計方法

個體基因雜合度Hi的計算：假設n是山羊基因組內(nèi)所有基因座的取樣，在取樣的n個基因座位中，雜合座位數(shù)Hl與取樣座位數(shù)n的比值Hi就是個體基因雜合度，其反映一個個體的基因雜合程度[12]。計算公式如下:

按照個體基因雜合度以0.15為步長，將107只湖北烏羊分為4個雜合度水平，用SAS（V8.1）統(tǒng)計軟件對不同雜合度水平與湖北烏羊的血液生化指標進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP基因雜合度

由13個SNP標記計算出的基因雜合度范圍在0.1538～0.6154，分為4個水平，結(jié)果見表2。表中平均觀察雜合度較低主要原因是在某些座位上，個體以純合子為主。

2.2 個體基因雜合度對湖北烏羊血液生化指標的影響

不同雜合度水平下血液生化指標的差異分析見表3，由表可見基因雜合度水平只對所測血液生化指標中的CK具有顯著影響（P＜0.05），其他血液生化指標在4個雜合度水平下均無顯著差異（P＞0.05）。雜合度水平為1（平均雜合度為0.2028）時，血液生化指標CK含量較高平均為306.22 U·L-1，雜合度水平為3（平均雜合度為0.4615）時，血液生化指標CK含量較低平均為234.52 U·L-1。

表2 個體基因雜合度Table2 Individual gene heterozygosity range for four levels

表3 各個體基因雜合度水平下湖北烏羊的血液生化指標Table3 Hubei Black-boned goat blood biochemical parameters at 4 levels for individual gene heterozygocity

3 討論與結(jié)論

機體通過血液循環(huán)將營養(yǎng)物質(zhì)運送到各組織細胞中，從而發(fā)揮營養(yǎng)調(diào)控作用以及一系列復雜的生化反應，因此血液生化指標某種程度上可以間接反應機體的健康狀況、應激和免疫能力。

本研究發(fā)現(xiàn)湖北烏羊血清中CK含量與個體基因雜合度之間存在倒鐘形曲線關系，CK含量先隨個體基因雜合度增加逐漸降低，在雜合度水平3（0.38～0.54）時，CK含量達到最低值，此時隨群體雜合度增加時CK水平反而會升高。多重比較表明雜合度水平1與雜合度水平3之間差異顯著（P＜0.05）；CK水平可以反映動物的應激，CK活性高則表示動物受到刺激時大量表達，表明該動物抗應激能力較弱[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)湖北烏羊的最適雜合度水平0.38＜hi≤0.53，說明此雜合度下湖北烏羊的抗應激能力可能較強。

除CK外，LDH是另一個與抗應激相關的指標。研究表明個體LDH水平越高，肌肉代謝水平越高，意味著動物抗應激能力越弱[13-14]。本研究中不同雜合度水平下湖北烏羊血清中LDH含量差異不顯著，但是雜合度水平3 LDH含量（352.12 U·L-1）略低于雜合度水平1（373.45 U·L-1），這與CK含量在雜合度水平1與雜合度水平3之間的變化趨勢相一致，CK含量低，LDH含量也相對較低，個體的抗應激能力相對較強。

GB是體液免疫的主要成分，其含量反映機體抗病能力。本研究中GB含量隨著雜合度的增加先升高后降低，在雜合度水平3時最高，更進一步揭示在雜合度水平3的情況下，湖北烏羊的抗應激能力可能最好，在選種過程中湖北烏羊個體基因雜合度最好控制在0.38～0.54水平，此雜合度水平下可能有利于提高湖北烏羊種群的抗應激能力使得適應性增強。

一般認為高雜合度與近交衰退呈負相關，與雜種優(yōu)勢呈正相關，但基因雜合度與機體性狀間不是簡單的相關關系[15]。根據(jù)不同雜合度水平分析，不同性狀的適當基因雜合度才能保證其最優(yōu)的含量水平或生產(chǎn)能力。

[1]Cam M A,Olfaz M,Soydan E.Body measurements reflect body weights and carcass yields in karayaka sheep[J].AsianJournal of Animal and Veterinary Advances,2010,5(2):120-127.

[2]Lee M,Godshalk E B,Lamkey K R.Association of restricton frag?ment length polymorphisms among maize inbred with agronomic performance of their crosses[J]Crop Science,1989,29:1067-1071.

[3]Dudley J W,Saghai M A,Rufener G K.Molecular marker informa?tion and grouping of parents in corn breeding programs[J].Crop Science,1991,31:718-723.

[4]吳曉林,李栒,Merete Fredholm.連續(xù)雜交下家豬微衛(wèi)星基因雜合度與經(jīng)濟性狀的相關性研究[J].遺傳學報,2001,28(1):20-28.

[5]王勇,張才駿,盧福山.歐拉羊的血紅蛋白多態(tài)性及其與血液指標的聯(lián)系[J].青海大學學報,2007(4):61-63.

[6]劉湘帆,王學峰,樊綺詩.聯(lián)合多個微衛(wèi)星DNA位點進行血友病B基因診斷[J].中華血液學雜志,2002,23(3):147-150.

[7]薩姆布魯克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.北京:科學出版社,1992.

[8]王憑青,魯浪,儲明星.孕酮受體多態(tài)性及其與濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)關系[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2009,42(5):1768-1775.

[9]孫瑞平,王利心,王建剛.山羊LHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關分析[J].西北農(nóng)林科大學學報,2009(6):53-55.

[10]張海軍,陳宏,房興唐.山羊MyoD基因家族多態(tài)性及與體尺性狀的相關性[J].遺傳,2007,29(9):1077-1082.

[11]Liu W J,Fang G X,FangY.The Polymorphism of a Mutation of IGF-1 Gene on Two Goat Breeds in China[J].Journal of Animal and Veterinary Advances.2010,9(4):790-794.

[12]姜勛平,熊遠著,劉桂瓊.豬個體基因雜合度對生產(chǎn)形狀的影響[J].遺傳學報,2003,30(5):431-436.

[13]Suchint S,Orawan C,Worapol A.Hematological,electrolyte and serum biochemical values of the Thai indigenous chickens(Gallus domesticus)in northeastern Thailand,Songklanakarin[J].J.Sci.Technol.2004,26(3):425-430

[14]Damir?ubcic.Some biochemical parameters in the blood of graz?ing German improved fawn goats from Istria,Croatia[J].Veterinar?ski Arhiv,2001,71(5):237-244.

[15]劉國慶,孫業(yè)良,楊利國.級進雜交綿羊微衛(wèi)星基因雜合度與生長性能的關系[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2006,29(1):67-71.